Blocage ciblé d'anticorps par un conjugaison bifonctionnel de peptide antigénique et de mimétrie fc-III (DCAF)
Summary
Le développement d’une conjugaison bifonctionnelle de peptide antigénique et de mimétique Fc-III (DCAF) est nouveau pour l’élimination des anticorps nocifs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse de la molécule DCAF1, qui peut bloquer sélectivement l’anticorps 4G2 pour éliminer l’effet d’amélioration dépendant des anticorps pendant l’infection de virus de dengue.
Abstract
L’élimination des anticorps nocifs des organismes est une approche précieuse pour l’intervention de maladies associées aux anticorps, telles que la dengue hémorragique et les maladies auto-immunes. Puisque des milliers d’anticorps avec différentes épitopes circulent dans le sang, aucune méthode universelle, excepté la conjugaison dual-fonctionnelle du peptide antigénique et de la mimétique de Fc-III (DCAF), n’a été rapportée pour cibler les anticorps nocifs spécifiques. Le développement de molécules DCAF apporte une contribution significative aux progrès de la thérapie ciblée, qui ont été démontrés pour éliminer l’effet d’amélioration dépendante des anticorps (ADE) dans un modèle d’infection par le virus de la dengue (DENV) et pour stimuler l’acétylcholine l’activité des récepteurs dans un modèle de myasthénie gravis. Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse d’une molécule de DCAF (DCAF1), qui peut bloquer sélectivement l’anticorps 4G2 pour atténuer l’effet d’ADE pendant l’infection de virus de dengue, et illustrer la liaison de l’anticorps de DCAF1 à 4G2 par un test d’ELISA. Dans notre méthode, DCAF1 est synthétisé par la conjugaison d’un dérivé d’hydrazine d’un peptide fc-III et d’un recombinant exprimé longtemps -helix avec séquence antigénique par la ligature chimique indigène (NCL). Ce protocole a été appliqué avec succès à DCAF1 ainsi qu’à d’autres molécules d’ADFA pour cibler leurs anticorps cognate.
Introduction
Les anticorps jouent un rôle important dans la réponse immunitaire humoristique pour la neutralisation des bactéries pathogènes et des virus1. Cependant, certains anticorps présentent des effets nocifs sur les organismes, tels que les anticorps réactifs croisés dans l’effet ADE pendant l’infection à DENV et les anticorps surréactifs dans les gravis de myasthénie, qui est une maladie auto-immune2,3. L’effet ADE est médié par les anticorps réactifs qui font le pont pour relier les cellules de présentation de DENV et de récepteur fc4,5, tandis que la myasthénie gravis est causée par les anticorps excessifs qui attaquent les récepteurs de l’acétylcholine entre les jonctions cellule-cellule dans le tissu musculaire6,7. Bien que des approches partiellement efficaces aient été développées pour traiter ces maladies8,9, sans aucun doute l’élimination directe de ces anticorps nocifs ferait des progrès pour les interventions.
Récemment, des molécules de DCAF, qui ont des groupes dual-fonctionnels, ont été développées pour le blocage ciblé d’anticorps10. DCAF est un long peptide qui est composé de 3 parties: 1) une partie d’antigène qui peut reconnaître spécifiquement l’anticorps cognate, 2) une étiquette Fc-III ou Fc-III-4C pour fortement lier à la région Fc de l’anticorps pour inhiber soit les récepteurs Fc ou compléter les protéines composant , 3) un long lien hélicoïdal qui conjugue ces deux groupes fonctionnels10. La partie de liaison, conçue à partir du domaine Moesin FERM, a été optimisée par le logiciel Rosseta pour s’assurer que la partie antigène et la partie Fc-III d’une molécule DCAF peuvent se lier simultanément aux régions Fab et Fc d’IgG. Quatre molécules de DCAF ont été synthétisées pour cibler 4 anticorps différents, dont DCAF1 a été utilisé pour éliminer l’anticorps 4G2, qui est un anticorps réactif croisé pendant l’infection de DENV pour contribuer à l’effet ADE ; et DACF4 a été conçu pour le sauvetage des récepteurs de l’acétylcholine en bloquant l’anticorps mab35 dans myasthenia gravis10.
Dans la présente étude, prise DCAF1 comme exemple, nous avons montré les protocoles pour la synthèse de la molécule DCAF et la détection de l’interaction entre un DCAF et son anticorps cognate. Le DCAF1 est semi-synthétisé par nCL approche11,12,13,14, qui conjugue le dérivé de l’hydrazine d’un peptide Fc-III et les parties exprimées linker-antigène ensemble. L’approche NCL présente des avantages significatifs par rapport à la synthèse entièrement chimique et à l’expression entièrement recombinante pour la synthèse DCAF1, car ces deux méthodes entraînent un faible rendement et un coût élevé. L’approche actuelle est non seulement le moyen le plus rentable d’obtenir le DCAF pleine longueur, mais peut également maintenir la conformation de la partie de liaison semblable à sa forme indigène. Puisque différentes molécules de DCAF ont des séquences semblables excepté les parties d’antigène, nos méthodes pour la synthèse de DCAF1 et l’analyse d’interaction entre l’anticorps de DCAF1 et 4G2 peuvent être appliquées à d’autres molécules de DCAF pour bloquer de cible leurs anticorps de cognate aussi bien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici la semi-synthèse et la détection de DCAF1 en utilisant l’approche NCL, qui est montrée dans la figure 1. En bref, les deux fragments de DCAF1 sont synthétisés chimiquement et recombinantement exprimés, respectivement ; ensuite, la molécule DCAF1 pleine longueur est assemblée, modifiée et purifiée. Pour la synthèse de fragments de Fc-III dérivée de l’hydrazine, l’utilisation de résine 2-Cl de faible capacité est très importante, car la capacité élev?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation Tsinghua University-Gates (non. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (no. 21502103, 21877068 et 041301475), et le National Key Research and Development Program of China (no. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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