Rensning af humane S100A12 og dets Ioninducerede oligomerer til Immuncelle stimulation
Summary
Denne protokol beskriver en rensningsmetode for rekombinant tagfrit calcium bindende protein S100A12 og dets ioninducerede oligomerer for humane monocyt-stimulerings analyser.
Abstract
I denne protokol beskriver vi en metode til at rense humant calcium bindende protein S100A12 og dets ion-inducerede oligomerer fra Escherichia coli -kulturen for immuncelle stimuleringer. Denne protokol er baseret på en to-trins kromatografi strategi, som består af protein forrensning på en anion-udvekslings kromatografikolonne og et efterfølgende polerings trin på en hydrofobe-interaktions kolonne. Denne strategi producerer S100A12 protein af høj renhed og udbytte til overkommelige omkostninger. For funktionelle assays på immunceller en eventuel rest endotoksin forurening kræver omhyggelig overvågning og yderligere rengøring trin for at opnå endotoksin-fri protein. De fleste af endotoksin forureninger kan udelukkes ved anionbytnings kromatografi. For at nedbryder resterende forureninger, denne protokol beskriver en fjernelse trin med centrifugal filtre. Afhængigt af den tilgængelige ion-styrke S100A12 kan arrangere i forskellige homomultimere. For at undersøge forholdet mellem struktur og funktion beskriver denne protokol yderligere Ion-behandling af S100A12 protein efterfulgt af kemisk tværbinding for at stabilisere S100A12 oligomerer og deres efterfølgende adskillelse efter størrelses udelukkelse Kromatografi. Endelig beskriver vi en celle baseret analyse, der bekræfter den biologiske aktivitet af det rensede protein og bekræfter LPS-fri forberedelse.
Introduction
S100A12 er et calcium bindende protein, som overvejende produceres af humane granulocytter. Proteinet over udtrykkes under (systemisk) inflammation og dets serumniveauer, især i (Auto) inflammatoriske sygdomme som systemisk juvenil idiopatisk arthritis (sJIA), familiær middelhavsfeber (FMF) eller Kawasakis sygdom (KD) kan informere om sygdomsaktivitet og respons på behandlingen. Afhængigt af mønstergenkendelse receptorer (PRRs) såsom bompenge-lignende receptorer (TLRs), det medfødte immunsystem kan aktiveres ved patogen-associerede molekylære mønstre (pamper) som lipopolysaccharider (LPS) eller skade tilknyttede molekylære mønstre (DAMPs; også betegnet “alarmins”). DAMPs er endogene molekyler såsom cellulære proteiner, lipider eller nukleinsyrer1. Fugtige funktioner er godt beskrevet for medlemmerne af calgranulin protein familien, S100A8/A9 og S100A122, som også rapporteres at fungere som divalent metal ion-chelerende antimikrobielle peptider3,4, 5,6. Afhængigt af den tilgængelige ion-styrke S100A12 kan, ligesom andre medlemmer af S100 familien, arrangere i forskellige homomultimere, og indtil for nylig var virkningen af S100A12-oligomerisering på PRR-interaktion, især TLR4, ukendt.
Proteinets monomeriske form (92 aminosyrer, 10,2 kDa) består af to EF-Hand Helix-loop-Helix-strukturer forbundet med en fleksibel linker. C-TERMINALENS EF-hånd indeholder det klassiske ca2 +bindende motiv, mens N-terminalens EF-hånd udviser en S100 protein specifik udvidet sløjfe struktur (“pseudo-EF-hånd”) og afslører reduceret ca2 +-affinitet. Ca2 +-binding af S100A12 kan inducere en større konformationsmæssige ændring i proteinerne C-Terminus, hvilket resulterer i eksponering af et hydrofobe plaster på hver monomer og danner denne-grænsefladen. Under fysiologiske forhold er den mindste kvaternære struktur dannet af S100A12 således en ikke-kovalent dimer (ca. 21 kDa), hvor individuelle monomerer er i antiparallel orientering. Når det er arrangeret som dimer, S100A12 er rapporteret til eller beslaglæggelse Zn2 + samt andre divalent metalioner, f. eks cu2 + med høj affinitet7. Disse ioner koordineres ved S100A12 dimer grænseflade af aminosyrer H15 og D25 af en underenhed og H85 samt H89 af anti-paralleling anden underenhed8,9,10. Mens tidligere undersøgelser foreslår, at Zn2 +-loaded S100A12 kan inducere proteinets organisation til homo-tetramers (44 kDa) og til at resultere i øget ca2 +-affinitet11,12, seneste metal titrering undersøgelser6 foreslår ca2 +-binding af S100A12 for at øge proteinets affinitet til Zn2 +. Når S100A12 EF-hænderne er fuldt besat af ca2 +, er yderligere ca2 + menes at binde mellem dimers, udløser hexamer formation (ca. 63 kDa). Arkitekturen i den hexameriske kvarternære struktur er klart forskellig fra den af tetramer. Det foreslås, at transthyretin-grænsefladen afbrydes for at give anledning til nye dimer-dimer-grænseflader, der gavner hexamer formation10. S100A12 er næsten udelukkende udtrykkes af humane granulocytter, hvor det udgør omkring 5% af alle cytosolisk protein13. I sin fugtige funktion S100A12 blev historisk beskrevet som agonist af multi-ligand-receptoren for avancerede glykering slutprodukter (Rage), derefter betegnet ekstracellulære nyligt identificerede Rage-binding protein (en-Rage)14. Omend vi tidligere rapporterede biokemiske S100A12-binding til både RAGE og TLR415, vi for nylig viste humane monocytter til at reagere på S100A12 stimulation i en TLR4-afhængig måde16. Dette kræver arrangement af S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-induceret hexameric Kvartære struktur16.
Her beskriver vi en rensnings procedure for rekombinant Human S100A12 og dens ion-inducerede oligomerer til immuncelle stimuleringer16,17. Dette er baseret på en to-trins kromatografi strategi, som i første omgang omfatter en anion-udvekslings kolonne for at isolere og koncentrere proteinet og fjerne masse forureninger (f. eks. endotoksiner/lipopolysaccharider)18. Ionbytningskromatografi harpiks udskille proteiner på grundlag af forskellige netto overflade ladninger. For sure proteiner som S100A12 (isoelektrisk punkt af 5,81), et buffersystem med en pH på 8,5 og en stærk anionbytter harpiks fører til en god adskillelse. Bundne proteiner blev elueret med et højsalt buffer forløb. Med en forøgelse af ionstyrke negative ioner i elueringsbufferen konkurrerer med proteiner for afgifter på overfladen af harpiks. Proteiner individuelt elueres afhængigt af deres netto ladning og i følge heraf, de buffere beskrevet heri gør det muligt at isolere og koncentrere det over udtrykte S100A12 protein. På grund af negativt ladede grupper i lipopolysaccharider binder disse molekyler sig også til anionbytter harpiks. Men deres højere netto ladning resulterer i senere eluering i den anvendte High-salt gradient. Det andet trin i rensningsproceduren er indført med henblik på polering. Dette gør brug af calcium binding evne S100A12 og fjerner resterende urenheder på en hydrofobe-interaktion kolonne. Calcium binding af S100A12 fører til en konformationel ændring og en eksponering af hydrofobe pletter på overfladen af proteinet. På denne betingelse, S100A12 interagerer med den hydrofobiske overflade af harpiks. Ved calcium-Chelat ved EDTA, denne interaktion er vendt. I nærværelse af ioner, især calcium og zink, S100A12 arrangerer til homomeriske oligomerer. For at studere struktur-funktion relationer af de forskellige oligomerer, stabiliserede vi dimeric, tetrameric og hexameric rekombinant S100A12 med en kemisk kryds linker og adskilte komplekser på en størrelses-udelukkelse kromatografikolonne. Endelig, at analysere funktionalitet og biologisk aktivitet af det rensede protein og dets ion-induceret oligomerer, cytokin frigivelse af S100A12 og LPS stimuleret monocyt kan sammenlignes.
Der er hidtil blevet beskrevet forskellige metoder til rensning af S100A12. F. eks. har Jackson et al.19udgivet en protokol med rensning via en anionbytnings kolonne og en efterfølgende kromatografi med størrelses udelukkelse. Rensning polering på en størrelse-udelukkelse kolonne fører til gode resultater, men-på grund af for eksempel begrænset lastning mængder-er mindre fleksibel i skalerbarhed. En anden tilgang, udgivet af Kiss et al.20, beskriver rensning af mærket protein via ni2 + affinitets kolonne som det første rensningstrin, efterfulgt af enzymatisk spaltning for at fjerne tagget og yderligere rensningstrin. I modsætning til de forlagte undersøgelser19,20, er det producerede protein som beskrevet i denne protokol bestemt til forsøg på immunceller. Derfor er rest endotoksin forurening fra bakteriel kultur en udfordring. Selv om der hidtil er blevet beskrevet forskellige tilgange til fjernelse af endotoksin, findes ingen ensartet metode, der fungerer lige godt for en given proteinopløsning21,22.
Sammenfattende kombinerer vores protokol fordelene ved et mærkat frit udtryk i et bakterie system med effektiv endotoksin fjernelse og højt udbytte af rent protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol beskriver vi tag-fri bakterielle udtryk for human S100A12 og dets rensning samt adskillelse i forskellige ion-induceret oligomerer til immuncelle stimulation. Sammenlignet med offentliggjort litteratur om S100A12 protein rensning8,23,24, brugen af høj CaCl2 (25 mm) i hydrofobe-interaktion kromatografi er at vores viden unik. Flere protokoller, der anvender koncentrationer fra 1 til 5 mM producerer re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra det murene innovative Medical Research program fra Muenster University Medical Faculty (KE121201 to C.K.) og den tyske Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 til D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
