טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.
Abstract
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה כדי לטהר את החלבון האנושי מחייב S100A12 החלבונים ואת oligomers המושרה שלה מפני es, המנוכיה קולי התרבות לגירוי התא החיסונית. פרוטוקול זה מבוסס על אסטרטגיה בעלת שני שלבים כרומטוגרפיה, הכוללת את החלבון הטרום-טיהור בטור כרומטוגרפיה של anion-exchange וצעד נוסף ליטוש בטור של אינטראקציה הידרופובי. אסטרטגיה זו מייצרת חלבון S100A12 של טוהר גבוהה ותשואה על עלויות לניהול. עבור מוסר פונקציונלי על התאים החיסוניים בסופו של דבר שארית זיהום אנדוטוקסין דורש ניטור זהיר ועוד לנקות את הצעדים כדי להשיג חלבון אנדוטוקסין ללא. רוב זהום אנדוטוקסין יכול להיות מנשלל על ידי האניב-exchange כרומטוגרפיה. כדי לרוקן זהום שיורית, פרוטוקול זה מתאר שלב ההסרה עם מסננים צנטריפוגליים. בהתאם לS100A12 של כוח היון הזמין יכול לארגן הומוגוטיימרים שונים. כדי לחקור את הקשר בין מבנה לפונקציה, פרוטוקול זה מתאר עוד את יון-הטיפול של חלבון S100A12 ואחריו כימיים המקשרים לייצב S100A12 oligomers והפרדה הבאים שלהם לפי גודל-להדרה כרומטוגרפיה. לבסוף, אנו מתארים שיטת תא המאשרת את הפעילות הביולוגית של החלבון הטהור ומאשרת הכנה ל-LPS ללא תשלום.
Introduction
S100A12 הוא חלבון מחייב סידן אשר מופק בעיקר על ידי האדם גרנולוציטים. החלבון הוא ביטוי מוגזם במהלך (מערכתי) דלקת רמות הסרום שלה, במיוחד (אוטומטי) מחלות דלקתיות כגון דלקת מפרקים אידיופטית מערכתית (sJIA), קדחת ים תיכונית משפחתית (FMF) או מחלת קווסאקי (KD) יכול להודיע על פעילות מחלה ותגובה לטיפול. בהתאם לקולטני זיהוי תבניות (PRRs) כגון קולטנים למספרי חיוג (TLRs), מערכת החיסון הטבועה יכולה להיות מופעלת על-ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן (PAMPs) כמו ליפופולפידים (LPS) או נזק דפוסי מולקולרי הקשורים (DAMPs; נקרא גם ‘ מדאיג ‘. DAMPs הם מולקולות אנדוגני כגון חלבונים סלולריים, שומנים או חומצות גרעין1. לח-פונקציות מתוארות היטב עבור חברי משפחת החלבון calgranulin, S100A8/A9 ו S100A122, אשר מדווחים גם לפעול כמו מתכת יון-הכלג1 פפטידים מיקרוביאלית3,4, 5,6. בהתאם ל-ion הזמין S100A12 יכול, כמו חברים אחרים של משפחת S100, לסדר לתוך הומומרים שונים עד לאחרונה ההשפעה של S100A12-oligomerisation התאמה על PRR-אינטראקציה, במיוחד TLR4, לא היה ידוע.
טופס monomeric של חלבון (92 חומצות אמינו, 10.2 kDa) מורכב משני מבנים EF-לולאה-סליל הסליל מחובר על ידי מקשר גמיש. C-טרמינל ef-יד מכיל את המוטיב הקלאסי של Ca2 +-מחייב בעוד N-טרמינל ef-יד המוצגים S100 חלבון-מבנה ספציפי לולאה מורחבת (“פסאודו-EF-יד”) ומגלה Ca מופחת2 +-אהדה. Ca2 +-קשירה על ידי S100A12 יכול לגרום לשינוי הגדול ביותר של החלבונים ‘ C-הטרמינוס, אשר גורמת לחשיפה של תיקון הידרופובי על כל מונומר וצורות ממשק dimerization. כך, בתנאים פיסיולוגיים, המבנה הרבעוני הקטן ביותר שנוצר על ידי S100A12 הוא דיימר לא-חד-ממדי (כ -21 kda) שבו מונמרים בודדים נמצאים בכיוון אנטי מקבילי. כאשר מסודרים כמו dimer, S100A12 מדווחת Zn 2 + כמו גם יוני מתכתדיאטתיים אחרים, למשל, Cu2 + עם אהדה גבוהה7. היונים הללו מתואמים בממשק S100A12 דימר על ידי חומצות אמינו H15 וD25 של יחידת משנה אחת וH85, כמו גם H89 של משנה אנטי מקבילים השני8,9,10. בעוד מחקרים מוקדם יותר להציע zn2 +-טעון S100A12 עשוי לגרום לארגון של חלבון לתוך הומו-טטרמרס (44 kda) וכתוצאה מכך מוגברת Ca2 +-אהדה11,12, טיטור מתכת לאחרונה מחקרים6 מציעים Ca2 +-מחייב על ידי S100A12 כדי להגביר את הזיקה של חלבון zn2 +. לאחר S100A12 EF-הידיים מאוכלס באופן מלא על ידי Ca2 +, ca נוסף2 + הוא חשב לאגד בין dimers, מפעיל היווצרות הבוחנים (כ 63 kda). הארכיטקטורה של המבנה האפארי של ההקאמארה שונה בבירור מזו של הטטרמר. הוא הציע כי ממשק הטטרמר משתבש כדי לתת עלייה ממשקי dimer החדש, אשר מועילה היווצרות הבוחנים10. S100A12 מתבטא כמעט באופן בלעדי על ידי הגרנולוציטים האדם שבו הוא מהווה כ 5% חלבון ציטוסולג13. בפונקציה לח שלה S100A12 היה מתואר היסטורית כמו אגוניסט של multi-ליגציה עבור גליקטיון מתקדם מוצרי הקצה (זעם), ולאחר מכן כינה מוצרים שזוהו לאחרונה חלבון כריכת זעם (EN-זעם)14. אף על פי שדווחו קודם לכן כS100A12 ביוכימיים לזעם ולTLR415, הדגמנו לאחרונה מונוציטים אנושיים כדי להגיב לגירוי S100A12באופןהתלוי בTLR4. זה דורש הסדר של S100A12 לתוך Ca שלה2 +/zn2 +-המושרה מבנה הקסעון הרבע16.
כאן אנו מתארים הליך טיהור עבור רקומביננטי S100A12 האנושי ואת oligomers יון המושרה שלה לגירוי תא החיסון16,17. זה מבוסס על אסטרטגיה בעלת שני שלבים כרומטוגרפיה, אשר כוללת בתחילה טור anion-exchange כדי לבודד ולרכז את החלבון ולהסיר זהום בצובר (למשל, אנטוקסינים/ליפופוליסכרידים)18. לחילופין, כרומטוגרפיה שרפים חלבונים נפרדים על בסיס של חיובים שונים של פני השטח נטו. עבור חלבונים חומציים כמו S100A12 (נקודת איזואלקטריים של 5.81), מערכת מאגר עם pH של 8.5 ו שרף anion-exchange חזק מוביל הפרדה טובה. חלבונים מאוגדים הובלו עם מעבר מבריק של מאגר מלח גבוה. עם עלייה של יוני יוני שלילי החוזק במאגר להתחרות עם חלבונים עבור חיובים על פני השטח של שרף. חלבונים בנפרד elute בהתאם לחיוב הנטו שלהם וכתוצאה מכך, המאגרים המתוארים כאן מאפשרים לבודד ולרכז את החלבון S100A12 ביטוי יתר. בשל קבוצות טעונה שלילית ליפופוליסכדים, מולקולות אלה גם לאגד anion-exchange שרפים. עם זאת, החיוב הנטו הגבוה יותר שלהם מביא להאצלת מאוחר יותר את מעבר הצבע הגבוה של המלח. השלב השני של תהליך הטיהור הוצג לצורך הליטוש. זה עושה שימוש ביכולת כריכת הסידן של S100A12 ומסיר את הנותרים זיהומים על העמוד אינטראקציה הידרופובי. כריכת סידן של S100A12 מוביל לשינוי הקונפורמציה וחשיפה של טלאים הידרופובי על פני השטח של החלבון. במצב זה, S100A12 מקיים אינטראקציה עם משטח ההידרופובי של השרף. על ידי הסידן-מכלפת על ידי EDTA, אינטראקציה זו היא הפוכה. בנוכחות יונים, במיוחד סידן ואבץ, S100A12 מארגן לתוך הומומרים oligomers. כדי לחקור את מבנה היחסים בתפקוד של oligomers שונים, אנו התייצב dimeric, tetrameric ו hexameric רקומביננטי S100A12 עם מקשר כימי והפרידו את התסביכים על עמוד בגודל כרומטוגרפיה הדרה. לבסוף, כדי לנתח את הפונקציונליות ואת הפעילות הביולוגית של החלבון מטוהרים ואת oligomers המושרה היונים שלה, שחרור cy, S100A12 ו-LPS גירוי מונוציט ניתן להשוות.
שיטות שונות לטיהור S100A12 תוארו עד כה. ג’קסון ואח ‘19, למשל, פרסם פרוטוקול עם טיהור באמצעות עמודת anion-exchange וכרומטוגרפיה שלאחר הרחקה מהגודל. הליטוש טיהור על עמודה בעלת הגבלת גודל מוביל לתוצאות טובות, אך-בגלל לדוגמה לאמצעי אחסון מוגבלים בטעינה-הוא גמיש פחות במדרגיות. גישה שונה, שפורסם על ידי נשיקה ואח ‘20, מתאר טיהור של חלבון מתויג דרך Ni2 + טור אהדה כצעד הטיהור הראשון, ואחריו מחשוף אנזימטי כדי להסיר את התג ועוד שלבי הטיהור. בניגוד למחקרים שנערכו במהלך הלימודים19,20, החלבון המיוצר כפי שמתואר בפרוטוקול זה נקבע לניסויים על תאים חיסוניים. לכן, שארית זיהום אנטוקסין מהתרבות החיידקית היא אתגר. למרות שגישות שונות להסרת שורש הסרת רעלן כבר תוארו עד כה, אין שיטה אחידה הפועלת באותה מידה גם עבור כל פתרון חלבון נתון21,22.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו משלב את היתרונות של ביטוי ללא תגית במערכת חיידקית עם הסרת אנטוקסין יעיל ותשואה גבוהה של חלבון טהור.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים ביטוי בקטריאלי ללא תג של S100A12 האדם ואת הטיהור שלה, כמו גם הפרדה לתוך שונים המושרה יון oligomers הנגרמת על ידי גירוי תא החיסון. בהשוואה לספרות שפורסמה על טיהור חלבון S100A128,23,24, השימוש גבוה cacl2 (25 מ”מ) ב הידרופובי-אינטר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מתוך תוכנית המחקר הרפואי חדשני של אוניברסיטת Muenster הפקולטה לרפואה (KE121201 ל-ק. ק.) וקרן המחקר הגרמני (DFG, Fo354/3-1 כדי D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
