면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 그 이온 유도 올리고머의 정화
Summary
본 프로토콜은 인간 단핵구 자극 분석법에 대한 재조합 태그 없는 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 방법을 기술한다.
Abstract
본 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 대장균 배양으로부터 인간 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머를 정제하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 대한 단백질 사전 정제및 소수성 상호작용 컬럼의 후속 연마 단계를 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략을 기반으로 합니다. 이 전략은 관리 가능한 비용으로 고순도 및 수율의 S100A12 단백질을 생산합니다. 면역 세포에 기능적인 실험에 대 한 결국 잔재 endotoxin 오염 신중 한 모니터링 및 endotoxin 없는 단백질을 얻기 위해 추가 청소 단계를 필요. 내독소 오염의 대다수는 항이온 교환 크로마토그래피에 의해 제외될 수 있습니다. 잔류 오염을 고갈시키기 위해 이 프로토콜은 원심 필터를 사용하여 제거 단계를 설명합니다. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라 상이한 호모멀티머로 배열할 수 있다. 구조와 기능 사이의 관계를 조사하기 위해 이 프로토콜은 S100A12 단백질의 이온 처리를 더 설명하고 화학적 가교하여 S100A12 올리고머를 안정화시키고 크기 배제에 의한 후속 분리를 설명합니다. 크로마토그래피. 마지막으로, 우리는 정제된 단백질의 생물학적 활성을 확인하고 LPS 가 없는 제제를 확인하는 세포 기반 분석기를 기술한다.
Introduction
S100A12는 인간 과립구에 의해 주로 생성되는 칼슘 결합 단백질입니다. 단백질은 (전신) 염증 및 혈청 수준 동안 과발현되며, 특히 전신 성 청소년 특발성 관절염 (sJIA), 가족 지중해 열 (FMF) 또는 가와사키 질환 (KD)과 같은 (자동) 염증성 질환에서 질병 활동 및 치료에 대한 반응. 톨-유사 수용체(TLRs)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 따라, 선천적인 면역 계통은 리포폴리대당(LPS) 또는 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)에 의해 활성화될 수 있다. ‘알람’이라고도 불립니다. DAMPs는 세포 단백질, 지질 또는 핵산과 같은 내인성 분자1. DAMP 기능은 칼그라눌린 단백질 패밀리의 구성원인 S100A8/A9 및 S100A122의구성원에 대해 잘 설명되어 있으며, 이는 또한 이원성 금속 이온 킬레이트 화 항균 펩티드로 작동하는 것으로 보고되고3,4 ,4, 5,6. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라, S100 가족의 다른 구성원과 마찬가지로, 상이한 상동체로 배열하고 최근까지 PRR 상호 작용, 특히 TLR4에 S100A12-올리고머화의 영향은 알려지지 않았다.
단백질의 단모체 형태 (92 아미노산, 10.2 kDa)는 유연한 링커에 의해 연결된 두 개의 EF 손 나선 루프 나선 구조로 구성됩니다. C-단말EF-핸드는 고전적인Ca2+-결합 모티프를 포함하고 있는 반면,N-말단 EF-hand는 S100 단백질 특이적 확장 루프 구조(‘의사-EF-hand’)를 나타내며 감소된Ca2+-affinity를 보여줍니다. Ca2+-결합 은 단백질의 C-종단에 있는 중요한 형태 변화를 유도할 수 있고, 이는 각 단량체에 소수성 패치의 노출을 초래하고 이량화 인터페이스를 형성한다. 따라서, 생리적 조건하에서, S100A12에 의해 형성된 가장 작은 사각 구조는 개별 단량체가 반평행 방향으로 있는 비공유 이량체(약 21 kDa)이다. 이량체로 배열될 때, S100A12는 Zn2+ 뿐만 아니라 다른 원화 금속 이온들, 예를 들어,Cu2+가 높은 친화성7을가진 격리기로 보고된다. 이러한 이온은 하나의 서브유닛 및 H85의 아미노산 H15 및 D25뿐만 아니라 반병렬화 다른 서브유닛8,9,10의 H89에 의해 S100A12 디머 계면에서 조정된다. 이전 연구는 Zn2+-로드 S100A12호모 테트라머 (44 kDa)로 단백질의 조직을 유도하고 증가Ca2 +-affinity11,12,최근 금속 적정을 초래할 수 있음을 제안하는 동안 연구6 은 Zn 2 + 단백질의 친화도를 높이기 위해 S100A12에 의한 Ca2+-바인딩을 제안합니다. 일단 S100A12 EF-hands가 Ca2+에의해 완전히 점유되면, 추가 Ca2+는 hexamer 형성 (약 63 kDa)을 트리거링, 디머 사이에 결합하는 것으로 생각된다. hexameric 분기 구조의 구조는 tetramer의 아키텍처와 분명히 다릅니다. 테트라머 인터페이스가 중단되어 hexamer형성(10)에이점을 주는 새로운 디머-디머 인터페이스를 야기하는 것이 제안된다. S100A12는 거의 독점적으로 인간 과립구에 의해 발현되며, 여기서 모든 세포종 단백질13의약 5%를 구성한다. DAMP 기능에서 S100A12는 역사적으로 고급 당화 최종 제품(RAGE)에 대한 다중 리간드 수용체의 작용제로서 기술된 후, 세포외 에서 새로 확인된 RAGE 결합 단백질(EN-RAGE)14라고불림하였다. 이기는 하지만 우리는 이전에 보고된 생화학적 S100A12-분노 및 TLR415둘 다에 결합하고, 우리는 최근에 TLR4 의존적인 방식으로 S100A12 자극에 반응하는 인간 단핵구를입증하였다 16. 이를 위해서는 S100A12를 Ca2+ /Zn2+-유도 된 hexameric 분기 구조16에배치해야합니다.
여기서 우리는 면역 세포 자극에 대한 재조합 인간 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 절차를16,17에기술한다. 이것은 단백질을 분리하고 집중시키고 벌크 오염을 제거하기 위해 음이온 교환 컬럼을 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략에 기초합니다(예를 들어, 내독소/리포폴리사카라이드)18. 이온 교환 크로마토그래피는 다른 순 표면 전하에 기초하여 단백질을 분리합니다. S100A12(5.81의 등전점)와 같은 산성 단백질의 경우 pH가 8.5이고 강력한 음이온 교환 수지의 완충 시스템이 양호한 분리를 유도합니다. 바운드 단백질을 고염 완충구로 용출시켰다. 용출 완충제에서 이온 강도의 증가와 함께 수지의 표면에 전하를 위해 단백질과 경쟁한다. 단백질은 그들의 순 전하에 따라 개별적으로 용해되고 그 결과, 본원에 기재된 완충제는 과발현된 S100A12 단백질을 분리하고 농축할 수 있게 한다. 리포폴리당에서 음전하를 띤 그룹으로 인해, 이 분자는 음이온 교환 수지에도 결합합니다. 그러나, 이들의 높은 순전하로 인해 적용된 고염 구배에서 나중에 용출이 발생한다. 정제 절차의 두 번째 단계는 연마 목적으로 도입되었습니다. 이것은 S100A12의 칼슘 결합 능력을 이용하고 소수성 상호 작용 컬럼에 남아있는 불순물을 제거합니다. S100A12의 칼슘 결합은 단백질의 표면에 형성적 변화 및 소수성 패치의 노출을 유도한다. 그 조건에서, S100A12는 수지의 소수성 표면과 상호 작용한다. EDTA에 의해 칼슘 킬레이트에 의해, 이 상호 작용은 반전. 이온, 특히 칼슘과 아연이있는 경우 S100A12는 동종 올리고머로 배열됩니다. 상이한 올리고머의 구조-기능 관계를 연구하기 위해, 화학 적 가교로 디메릭, 테트라메릭 및 hexameric 재조합 S100A12를 안정화하고 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 복합체를 분리했습니다. 마지막으로, 정제된 단백질 및 이온 유도 올리고머의 기능 및 생물학적 활성을 분석하기 위해, S100A12 및 LPS 자극 단핵구의 사이토카인 방출을 비교할 수 있다.
S100A12를 정화하기 위한 다양한 방법이 지금까지 설명되어 왔다. Jackson 등19,예를 들어, 음이온 교환 컬럼 및 후속 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제가 있는 프로토콜을 발표했다. 크기 제외 열의 정화 연마는 좋은 결과를 초래하지만, 예를 들어 제한된 로딩 볼륨으로 인해 확장성이 덜 유연합니다. Kiss et al.20에의해 출판된 다른 접근법은Ni2+ 친화성 컬럼을 통한 태그된 단백질의 정제를 첫 번째 정제 단계로 설명하고, 이어서 효소 절단을 제거하여 태그를 제거하고 추가정제 단계를 수행한다. 상기19,20,이 프로토콜에 기재된 바와 같이 생산된 단백질은 상기 면역 세포에 대한 실험을 위해 결정된다. 따라서, 세균 배양으로부터의 잔재내독생 오염은 도전이다. 내독소 제거를 위한 다른 접근법이 지금까지 기술되었지만, 주어진 단백질 용액21,22에대해 동등하게 잘 작동하는 균일한 방법은 없다.
요약하자면, 당사의 프로토콜은 박테리아 시스템에서 태그 없는 발현의 장점을 효율적인 내독소 제거 및 순수 단백질의 높은 수율과 결합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 다른 이온 유도 된 올리고머로의 분리뿐만 아니라 인간 S100A12의 태그 없는 세균 발현 및 그것의 정제를 기술한다. S100A12 단백질 정제8,23,24에대한 출판 된 문헌과 비교하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피에서 높은 CaCl2 (25 mM)를 사용하는 것은 우리의 지식고유입니다. 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Muenster 대학 의학 교수의 교내 혁신적인 의학 연구 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (KE121201 C.K.에) 독일 연구 재단 (DFG, Fo354/3-1 D.F.)
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
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