Purificación del S100A12 humano y sus oligomeros inducidos por iones para la estimulación celular inmune
Summary
Este protocolo describe un método de purificación para la proteína de unión al calcio sin etiquetas recombinante S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones para ensayos de estimulación de monocitos humanos.
Abstract
En este protocolo, describimos un método para purificar la proteína humana de unión al calcio S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones del cultivo de Escherichia coli para estimulaciones de células inmunitarias. Este protocolo se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que comprende la pre-purificación de proteínas en una columna de cromatografía de intercambio de aniones y un paso de pulido posterior en una columna de interacción hidrofóbica. Esta estrategia produce proteína S100A12 de alta pureza y rendimiento a costos manejables. Para ensayos funcionales en células inmunitarias, la contaminación por endotoxinas remanentes requieren un control cuidadoso y más pasos de limpieza para obtener proteínalibre de endotoxinas. La mayoría de las contaminaciones por endotoxinas pueden excluirse mediante cromatografía de intercambio de aniones. Para agotar las contaminaciones residuales, este protocolo describe un paso de eliminación con filtros centrífugos. Dependiendo de la resistencia iónal disponible S100A12 puede organizarse en diferentes homomultimers. Para investigar la relación entre estructura y función, este protocolo describe además el tratamiento iónico de la proteína S100A12 seguido de la reticulación química para estabilizar los oligómeros S100A12 y su posterior separación por exclusión de tamaño Cromatografía. Por último, describimos un ensayo a base de células que confirma la actividad biológica de la proteína purificada y confirma la preparación libre de LPS.
Introduction
S100A12 es una proteína de unión al calcio que es producida predominantemente por granulocitos humanos. La proteína se sobreexpresa durante la inflamación (sistémica) y sus niveles séricos, particularmente en enfermedades (auto)inflamatorias como la artritis idiopática juvenil sistémica (SJIA), la fiebre mediterránea familiar (FMF) o la enfermedad de Kawasaki (KD) pueden informar sobre actividad de la enfermedad y la respuesta a la terapia. Dependiendo de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como receptores similares a los peajes (TLR), el sistema inmunitario innato puede ser activado por patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) como lipopolisacáridos (LPS) o patrones moleculares asociados al daño (DPP; también se denominan “alarmins”). Los DAPP son moléculas endógenas como proteínas celulares, lípidos o ácidos nucleicos1. Las funciones DAMP están bien descritas para los miembros de la familia de proteínas de calgranulina, S100A8/A9 y S100A122, que también se informa que funcionan como péptidos antimicrobianos de iones metálicos divalentes3,4, 5,6. Dependiendo de la resistencia iónica disponible S100A12 puede, al igual que otros miembros de la familia S100, organizarse en diferentes homomultimeros y hasta hace poco se desconocía el impacto del oligomerización S100A12 en la interacción PRR, particularmente TLR4.
La forma monomérica de la proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste en dos estructuras de hélice-bucle-hélice de mano EF conectadas por un vinculador flexible. El C-terminalEF-hand contiene el motivo clásico de unión Ca2+,mientras que el N-terminalEF-hand exhibe una estructura de bucle extendido específica de proteína S100 (‘pseudo-EF-hand’) y revela una reducción de Ca2+-afinidad. Ca2+-unión por S100A12 puede inducir un cambio de conformación importante en la proteína’ C-terminus, que resulta en la exposición de un parche hidrófobo en cada monómero y forma la interfaz de dimerización. Así, en condiciones fisiológicas, la estructura cuaternaria más pequeña formada por S100A12 es un dímero no covalente (aproximadamente 21 kDa) en el que los monómeros individuales están en orientación antiparalela. Cuando se organiza como dimer, S100A12 se divulga para secuestrar Zn2+ así como otros iones de metal divalente, por ejemplo, Cu2+ con alta afinidad7. Estos iones están coordinados en la interfaz de dimer S100A12 por los aminoácidos H15 y D25 de una subunidad y H85, así como H89 de la subunidad antiparalela8,9,10. Mientras que estudios anteriores proponen que Zn2+-cargado S100A12 puede inducir la organización de la proteína en homo-tetrameros (44 kDa) y para dar lugar a un aumento de Ca2+-afinidad11,12, reciente valoración de metal estudios6 sugieren Ca2+-unión por S100A12 para aumentar la afinidad de la proteína a Zn2+. Una vez que las manos EF S100A12 están completamente ocupadas por Ca2+,se cree que Ca2+ adicional se une entre dimers, desencadenando la formación de hexamer (aproximadamente 63 kDa). La arquitectura de la estructura de los barrios hexamíricos es claramente diferente de la del tetrámero. Se propone que la interfaz de los tetrámeros se interrumpa para dar lugar a nuevas interfaces dimer-dimer que benefician la formación de hexamer10. S100A12 es expresado casi exclusivamente por granulocitos humanos donde constituye alrededor del 5% de toda la proteína citosólica13. En su función DAMP S100A12 fue históricamente descrito como agonista del receptor multi-ligand para productos finales de glicación avanzada (RAGE), luego denominado proteína de unión RAGE (EN-RAGE)14. Aunque anteriormente informamos bioquímico S100A12-unión a RAGE y TLR415, recientemente demostramos monocitos humanos para responder a la estimulación S100A12 de una manera dependiente de TLR416. Esto requiere la disposición de S100A12 en su Ca2+/Zn2+-inducida estructura de trimestral hexameric16.
Aquí describimos un procedimiento de purificación para el S100A12 humano recombinante y sus oligómeros inducidos por iones para estimulaciones celulares inmunes16,17. Esto se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que inicialmente incluye una columna de intercambio de aniones para aislar y concentrar la proteína y eliminar las contaminaciones a granel (por ejemplo, endotoxinas/lipopolisacáridos)18. Las resinas de cromatografía de intercambio iónico separan las proteínas sobre la base de diferentes cargas netas de superficie. Para proteínas ácidas como S100A12 (punto isoeléctrico de 5.81), un sistema tampón con un pH de 8.5 y una resina fuerte de intercambio de aniones conduce a una buena separación. Las proteínas enlazadas se eluyen con un gradiente de tampón de alta sal. Con un aumento de iones negativos de fuerza iónica en el tampón de elución competir con las proteínas para las cargas en la superficie de la resina. Las proteínas eluyen individualmente dependiendo de su carga neta y en consecuencia, los tampones descritos en este documento permiten aislar y concentrar la proteína S100A12 sobreexpresada. Debido a grupos cargados negativamente en lipopolisacáridos, estas moléculas también se unen a resinas de intercambio de aniones. Sin embargo, su mayor carga neta resulta en la elución posterior en el gradiente de alta sal aplicado. El segundo paso del procedimiento de purificación se ha introducido con fines de pulido. Esto hace uso de la capacidad de unión al calcio de S100A12 y elimina las impurezas restantes en una columna hidrofóbica-interacción. La unión al calcio de S100A12 conduce a un cambio de conformación y a una exposición de parches hidrófobos en la superficie de la proteína. En esa condición, S100A12 interactúa con la superficie hidrófoba de la resina. Al quelar el calcio por EDTA, esta interacción se invierte. En presencia de iones, especialmente calcio y zinc, S100A12 se organiza en oligómeros homoméricos. Para estudiar las relaciones estructura-función de los diferentes oligómeros, estabilizamos el recombinante dimerico, tetramírico y hexámero S100A12 con un retitulador químico y separamos los complejos en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Por último, para analizar la funcionalidad y la actividad biológica de la proteína purificada y sus oligómeros inducidos por iones, se puede comparar la liberación de citoquinas de S100A12 y lpS estimulado monocitos.
Hasta el momento se han descrito varios métodos para purificar S100A12. 19, por ejemplo, publicaron un protocolo con purificación a través de una columna de intercambio de aniones y una posterior cromatografía de exclusión de tamaño. El pulido de purificación en una columna de exclusión de tamaño da como resultado buenos resultados, pero, por ejemplo, debido a volúmenes de carga limitados, es menos flexible en escalabilidad. Un enfoque diferente, publicado por Kiss et al.20, describe la purificación de la proteína etiquetada a través de la columna de afinidad Ni2+ como el primer paso de purificación, seguido de escisión enzimática para eliminar la etiqueta y otros pasos de purificación. A diferencia de los estudios citados19,20, la proteína producida como se describe en este protocolo se determina para experimentos en células inmunitarias. Por lo tanto, la contaminación por endotoxinas remanentes del cultivo bacteriano es un desafío. Aunque hasta ahora se han descrito diferentes enfoques para la eliminación de endotoxinas, no existe un método uniforme que funcione igual de bien para cualquier solución proteicadada 21,22.
En resumen, nuestro protocolo combina las ventajas de una expresión libre de etiquetas en un sistema bacteriano con eliminación eficiente de endotoxinas y alto rendimiento de proteína pura.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, describimos la expresión bacteriana libre de etiquetas del S100A12 humano y su purificación, así como la separación en diferentes oligómeros inducidos por iones para la estimulación de células inmunitarias. En comparación con la literatura publicada sobre la purificación de proteínas S100A128,23,24, el uso de caCl2 alto (25 mM) en la cromatografía de interacción hidrofóbica es para nues…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones del programa de investigación médica innovadora intramuros de la facultad de medicina de la Universidad de Muenster (KE121201 a C.K.) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
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