प्रतिरक्षा सेल उत्तेजना के लिए मानव S100A12 और इसके आयन प्रेरित Oligomers की शुद्धि
Summary
इस प्रोटोकॉल पुनः संयोजक टैग मुक्त कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन S100A12 और मानव monocyte उत्तेजना परख के लिए अपने आयन प्रेरित oligomers के लिए एक शुद्धि विधि का वर्णन करता है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन S100A12 और प्रतिरक्षा सेल उत्तेजनाओं के लिए Escherichia कोलाई संस्कृति से अपने आयन प्रेरित oligomers शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन. यह प्रोटोकॉल एक दो कदम क्रोमैटोग्राफी रणनीति पर आधारित है, जिसमें एक आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर प्रोटीन पूर्व-शुद्धि और हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन कॉलम पर बाद में पॉलिश करने का चरण शामिल है। इस रणनीति प्रबंधनीय लागत पर उच्च शुद्धता और उपज के S100A12 प्रोटीन का उत्पादन. प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर कार्यात्मक परख के लिए अंतिम अवशेष endotoxin संदूषण सावधान निगरानी और आगे की सफाई कदम endotoxin मुक्त प्रोटीन प्राप्त करने की आवश्यकता है. एंडोटॉक्सिन संदूषण के बहुमत anion-exchange क्रोमैटोग्राफी द्वारा बाहर रखा जा सकता है। अवशिष्ट संदूषण को कम करने के लिए, यह प्रोटोकॉल केन्द्रापसारक फ़िल्टर के साथ एक हटाने के चरण का वर्णन करता है। उपलब्ध आयन शक्ति S100A12 के आधार पर विभिन्न homomultimers में व्यवस्था कर सकते हैं. संरचना और समारोह के बीच संबंधों की जांच करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आगे S100A12 प्रोटीन के आयन उपचार का वर्णन करता है उसके बाद रासायनिक crosslinking S100A12 oligomers और आकार-निष्कर्ष द्वारा उनके बाद जुदाई को स्थिर करने के लिए क्रोमैटोग्राफी. अंत में, हम एक सेल आधारित परख है कि शुद्ध प्रोटीन की जैविक गतिविधि की पुष्टि करता है और LPS मुक्त तैयारी की पुष्टि का वर्णन.
Introduction
S100A12 एक कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन है जो मुख्य रूप से मानव granulocytes द्वारा उत्पादित है. प्रोटीन (प्रणालीगत) सूजन और उसके सीरम के स्तर के दौरान overexpressed है, विशेष रूप से (ऑटो) भड़काऊ रोगों जैसे प्रणालीगत किशोर अज्ञातहेतुक गठिया (sJIA), पारिवारिक भूमध्य बुखार (FMF) या कावासाकी रोग (KD) के बारे में सूचित कर सकते हैं रोग गतिविधि और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया. पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) जैसे टोल-जैसे रिसेप्टर्स (TLRs) के आधार पर, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली रोगजनक-संबद्ध आणविक पैटर्न (पीएएमपी) जैसे lipopolissaccharides (LPS) या क्षतिग्रस्त संबंधित आणविक पैटर्न (DAMPs; इसे ‘अलार्मिन्स’ भी कहा जाता है। DAMPs कोशिकीय प्रोटीन, लिपिड या न्यूक्लिक एसिड1जैसे अंतर्जात अणु हैं। DAMP-कार्यअच्छी calgranulin प्रोटीन परिवार के सदस्यों के लिए अच्छी तरह से वर्णित हैं, S100A8/A9 और S100A122, जो भी divalent धातु आयन-चेलेटिंग एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स3,4, के रूप में संचालित करने के लिए सूचित कर रहे हैं 5,6. उपलब्ध आयन शक्ति S100A12 पर निर्भर करता है, S100 परिवार के अन्य सदस्यों की तरह कर सकते हैं, विभिन्न homomultimers में व्यवस्था और हाल ही में जब तक PRR-इंटरैक्शन पर S100A12-ओलिगोमेरण के प्रभाव, विशेष रूप से TLR4, अज्ञात था.
प्रोटीन के monomeric रूप (92 एमिनो एसिड, 10.2 kDa) दो EF हाथ हेलिक्स-लूप-हेलिक्स संरचनाओं के होते हैं एक लचीला linker द्वारा जुड़े. सी-टर्मिनलEF-hand में क्लासिकल Ca2+-बाइंडिंग आकृति शामिल है, जबकि N-टर्मिनलEF-hand एक S100 प्रोटीन-विशिष्ट विस्तारित लूप संरचना (‘pseudo-EF-hand’) को दर्शाती है और कम Ca2+-एफ़िनिटी का पता चलता है। Ca2 +– S100A12 द्वारा बाध्यकारी प्रोटीन ‘सी-टर्मिनस, जो प्रत्येक मोनोमर पर एक हाइड्रोफोबिक पैच के जोखिम में परिणाम में एक प्रमुख अनुरूप परिवर्तन प्रेरित कर सकते हैं और dimerization इंटरफ़ेस रूपों. इस प्रकार, शारीरिक परिस्थितियों के तहत, S100A12 द्वारा गठित सबसे छोटी चतुष्क संरचना एक गैर-सहसंयोजक dimer (लगभग 21 केडीए) जिसमें व्यक्तिगत monomers antiparallel अभिविन्यास में हैं. जब dimer के रूप में व्यवस्था की, S100A12 सेक्यूलर n2 + के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य divalent धातु आयनों, जैसे, Cu2 + उच्च संबंध7के साथ सूचित किया जाता है। इन आयनों को एस 100ए12 डाइमर अंतराफलक में एमिनो एसिड ्सएच15 तथा एक उपइकाई तथा एच 85 के साथ-साथ अन्य उपइकाई8,9,10के एच 89 के एमिनो एसिडों H15 तथा D25 के साथ-साथ H89 में समन्वित किया जाता है । जबकि पहले के अध्ययनों का प्रस्ताव है कि n2 +-लोडS12 होमो-tetramers (44 kDa) में प्रोटीन के संगठन प्रेरित कर सकते हैं और वृद्धि हुई Ca2 +-affinity11,12, हाल ही में धातु अनुमापन में परिणाम अध्ययन6 सुझाव Ca2 +-s100A12 द्वारा बाध्यकारी करने के लिए $n 2+के लिए प्रोटीन की आत्मीयता बढ़ाने के लिए . एक बार S100A12 EF-हाथों पूरी तरह से Ca2 +द्वारा कब्जा कर रहे हैं, अतिरिक्त Ca2 + dimers के बीच बाँध करने के लिए सोचा है, hexamer गठन ट्रिगर (लगभग 63 kDa). हेक्सामेरिक क्वार्टरनारी संरचना की वास्तुकला टेट्रामर से स्पष्ट रूप से भिन्न है। यह प्रस्ताव है कि टेट्रामर इंटरफेस को नए डाइमर-डिमर इंटरफेस को जन्म देने के लिए बाधित किया जाता है जो हेक्सामेर गठन10को लाभ पहुंचाता है। S100A12 लगभग विशेष रूप से मानव granulocytes द्वारा व्यक्त की है, जहां यह सभी साइटोसोलिक प्रोटीन13के बारे में 5% का गठन . अपने DAMP समारोह में S100A12 ऐतिहासिक उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पादों (RAGE) के लिए बहु-लिगंड रिसेप्टर के एगोनिस्ट के रूप में वर्णित किया गया था, तो अतिरिक्त कोशिकीय नव पहचान RAGE बाध्यकारी प्रोटीन (EN-RAGE)14कहा जाता है. Albeit हम पहले दोनों RAGE और TLR415के लिए जैव रासायनिक S100A12 बाध्यकारी की सूचना दी, हम हाल ही में मानव monocytes का प्रदर्शन करने के लिए एक TLR4 पर निर्भर तरीके से16में S100A12 उत्तेजना का जवाब . इसके लिए S100A12 की व्यवस्था की आवश्यकता है इसके Ca2+/n2 +-प्रेरित हेक्सामेरिक तिमाही संरचना16में ।
यहाँ हम पुनः संयोजक मानव S100A12 और प्रतिरक्षा सेल उत्तेजनाओं के लिए अपने आयन प्रेरित oligomers के लिए एक शुद्धि प्रक्रिया का वर्णन16,17. यह एक दो कदम क्रोमैटोग्राफी रणनीति पर आधारित है, जो शुरू में एक anion विनिमय स्तंभ को अलग करने और प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने और थोक संदूषण को दूर करने के लिए भी शामिल है (उदा., endotoxins /lipopolysaccharides)18. आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी रेजिन अलग-अलग शुद्ध सतह शुल्क के आधार पर अलग प्रोटीन। S100A12 की तरह अम्लीय प्रोटीन के लिए (5.81 के isoelectric बिंदु), 8.5 के पीएच के साथ एक बफर प्रणाली और एक मजबूत anion विनिमय राल एक अच्छा जुदाई की ओर जाता है. बाउंड प्रोटीन एक उच्च नमक बफर ढाल के साथ eluted थे. एल्यूशन बफर में आयनिक शक्ति नकारात्मक आयनों की वृद्धि के साथ राल की सतह पर शुल्क के लिए प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। प्रोटीन व्यक्तिगत रूप से अपने शुद्ध प्रभारी के आधार पर और उसके परिणाम स्वरूप, यहाँ वर्णित बफ़र्स को अलग करने और overexpressed S100A12 प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देते हैं. लिपोपॉलिसैकेराइड में ऋणावेशित समूहों के कारण, ये अणु ओनियन-विनिमय रेजिन से भी बांधते हैं। तथापि, उनके उच्च निवल आवेश के परिणामस्वरूप बाद में अनुप्रयुक्त उच्च लवण प्रवणता में निरूपित हो जाता है। शुद्धीकरण प्रक्रिया का दूसरा चरण पॉलिश करने के उद्देश्यों के लिए शुरू किया गया है। यह S100A12 के कैल्शियम बाध्यकारी क्षमता का उपयोग करता है और एक हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन कॉलम पर शेष अशुद्धियों को हटा देता है। S100A12 के कैल्शियम बाध्यकारी एक अनुरूप परिवर्तन और प्रोटीन की सतह पर हाइड्रोफोबिक पैच के एक जोखिम की ओर जाता है. उस हालत पर, S100A12 राल के हाइड्रोफोबिक सतह के साथ सूचना का आदान-इन. EDTA द्वारा कैल्शियम-chelating पर, इस बातचीत उलट है. आयनों की उपस्थिति में, विशेष रूप से कैल्शियम और जस्ता, S100A12 homomeric oligomers में व्यवस्था. विभिन्न ओलिगोमर की संरचना-फ़ंक्शन संबंधों का अध्ययन करने के लिए, हम एक रासायनिक क्रॉसलिंकर के साथ डिमेरिक, टेट्रामेरिक और हेक्सामेरिक पुनः संयोजक S100A12 स्थिर हो गए और एक आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर परिसरों को अलग कर दिया। अंत में, शुद्ध प्रोटीन और उसके आयन प्रेरित oligomers की कार्यक्षमता और जैविक गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, S100A12 के cytokine रिलीज और एलपीएस प्रेरित monocyte तुलना की जा सकती है.
S100A12 को शुद्ध करने के लिए विभिन्न तरीकों अब तक वर्णित किया गया है. जैक्सन एट अल19, उदाहरण के लिए, एक anion विनिमय स्तंभ और बाद में आकार बहिष्कार क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्धि के साथ एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया. एक आकार-निष्कर्ष स्तंभ पर शुद्धीकरण पॉलिश करने से अच्छे परिणाम प्राप्त होते हैं, लेकिन उदाहरण के लिए सीमित लोडिंग वॉल्यूम के कारण यह मापनीयता में कम लचीला होता है। Kiss et al.20द्वारा प्रकाशित एक अलग दृष्टिकोण, Ni2 + आत्मीयता कॉलम के माध्यम से टैग किए गए प्रोटीन की शुद्धि का वर्णन पहले शुद्धि कदम के रूप में, एंजाइमी दरार द्वारा पीछा टैग और आगे शुद्धि कदम को दूर करने के लिए. पहले से किए गए अध्ययनों के विपरीत19,20, इस प्रोटोकॉल में वर्णित उत्पादित प्रोटीन प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर प्रयोगों के लिए निर्धारित किया जाता है। इसलिए, जीवाणु संस्कृति से अवशेष एंडोटॉक्सिन संदूषण एक चुनौती है। यद्यपि एंडोटॉक्सिन हटाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का अब तक वर्णन नहीं किया गया है , फिर भी ऐसी कोई एक समान विधि नहीं है जो किसी भी प्रोटीन समाधान21,22के लिए समान रूप से अच्छी तरह से कार्य करती है .
संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल कुशल endotoxin हटाने और शुद्ध प्रोटीन की उच्च उपज के साथ एक जीवाणु प्रणाली में एक टैग मुक्त अभिव्यक्ति के फायदे को जोड़ती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव S100A12 के टैग मुक्त जीवाणु अभिव्यक्ति और इसके शुद्धि के साथ ही प्रतिरक्षा सेल उत्तेजना के लिए विभिन्न आयन प्रेरित oligomers में जुदाई का वर्णन. S100A12 प्रोटीनशुद्धि8 , 23,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन Muenster विश्वविद्यालय चिकित्सा संकाय के intramural अभिनव चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (KE121201 सी.के.) और जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG, Fo354/
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
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