Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie
Summary
Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.
Abstract
In dit protocol beschrijven we een methode om humaan calcium bindende proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren te zuiveren van de Escherichia coli -cultuur voor immuuncelstimulaties. Dit protocol is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die bestaat uit eiwit voorzuivering op een anion-uitwisselings chromatografie kolom en een daaropvolgende polijst stap op een hydrofobe-interactie kolom. Deze strategie produceert S100A12 eiwit van hoge zuiverheid en rendement tegen beheersbare kosten. Voor functionele assays op immuuncellen vereist uiteindelijke restant endotoxine besmetting zorgvuldige controle en verdere reinigingsstappen om endotoxine vrij eiwit te verkrijgen. De meerderheid van de endotoxine verontreinigingen kan worden uitgesloten door een anion-uitwisselings chromatografie. Om rest verontreinigingen uit te putten, beschrijft dit protocol een verwijderings stap met centrifugale filters. Afhankelijk van de beschikbare Ion-sterkte S100A12 kan regelen in verschillende homomultimers. Om de relatie tussen structuur en functie te onderzoeken, wordt dit Protocol verder beschreven Ion-behandeling van S100A12 eiwit, gevolgd door chemische crosslinking te stabiliseren S100A12 oligomeren en hun daaropvolgende scheiding door grootte-uitsluiting Chromatografie. Ten slotte beschrijven we een cel-gebaseerde assay die de biologische activiteit van het gezuiverde eiwit bevestigt en LPS-vrije voorbereiding bevestigt.
Introduction
S100A12 is een calcium bindend eiwit dat voornamelijk wordt geproduceerd door menselijke granulocyten. Het eiwit wordt overgedruct tijdens (systemische) ontsteking en de serumspiegels, met name bij (auto) ontstekingsziekten zoals systemische juveniele idiopathische artritis (sJIA), familiaire mediterrane koorts (FMF) of ziekte van Kawasaki (KD) kan informeren over ziekteactiviteit en respons op de therapie. Afhankelijk van patroonherkenning receptoren (PRRs) zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), het aangeboren immuunsysteem kan worden geactiveerd door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zoals lipopolysacchariden (LPS) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs; ook wel ‘ alarmin ‘ genoemd). DAMPs zijn endogene moleculen zoals cellulaire eiwitten, lipiden of nucleïnezuren1. Vocht-functies zijn goed beschreven voor de leden van de calgranulin proteïne familie, S100A8/A9 en S100A122, die ook worden gerapporteerd om te werken als divalente metalen Ion-chelerende antimicrobiële peptiden3,4, 5,6. Afhankelijk van de beschikbare ionensterkte kan S100A12, net als andere leden van de S100-familie, verschillende homomultimers regelen en tot voor kort was de impact van S100A12-oligomerisatie op PRR-interactie, in het bijzonder TLR4, onbekend.
Het eiwit monomere vorm (92 aminozuren, 10,2 kDa) bestaat uit twee EF-hand Helix-lus-Helix structuren verbonden door een flexibele linker. De C-Terminal EF-hand bevat het klassieke CA2 +-bindende motief, terwijl de N-terminale EF-hand een S100 eiwit-specifieke verlengde LUSSTRUCTUUR (‘ pseudo-EF-hand ‘) vertoont en een gereduceerde CA2 +-affiniteit onthult. CA2 +-binding door S100A12 kan leiden tot een belangrijke conformationele verandering in het C-terminus van de eiwitten, wat resulteert in blootstelling van een hydrofobe pleister op elk monomeer en vormt de door dimerisatie-interface. Zo is de kleinste Kwartaire structuur, gevormd door S100A12, onder fysiologische omstandigheden, een niet-covalente dimeer (ongeveer 21 kDa) waarin individuele monomeren in anti parallelle oriëntatie zijn. Wanneer gerangschikt als dimer, wordt S100A12 gerapporteerd aan onttrokken Zn2 + en andere divalente metaalionen, bijvoorbeeld Cu2 + met hoge affiniteit7. Deze ionen worden gecoördineerd op de S100A12 dimeer-interface door aminozuren H15 en D25 van een subeenheid en H85, evenals H89 van de anti-paralleling andere subeenheid8,9,10. Terwijl eerdere studies voorstellen datZn 2 +-loaded S100A12 de eiwit organisatie kan induceren in homo-tetramers (44 kDa) en resulteert in een verhoogdeca 2 +-affiniteit11,12, recente metaal titratie studies6 suggereren CA2 +-binding door S100A12 om de eiwit affiniteit te verhogen tot Zn2 +. Zodra de S100A12 EF-handen volledig bezet zijn door CA2 +, wordt extra CA2 + verondersteld te binden tussen dimers, triggering hexamer vorming (ongeveer 63 kDa). De architectuur van de hexamerische Kwartaire structuur verschilt duidelijk van die van de Tetramer. Er wordt voorgesteld dat de tetrameer-interface wordt verstoord om nieuwe dimer-dimer-interfaces te geven die de voordelen van hexamer-formatie10hebben. S100A12 wordt bijna uitsluitend uitgedrukt door menselijke Granulocyten, waar het ongeveer 5% van alle cytosolische eiwitten13vormt. In zijn VOCHTIGE functie werd S100A12 historisch beschreven als agonist van de multi-ligand receptor voor geavanceerde glycation end-producten (RAGE), dan genoemd extracellulaire nieuw geïdentificeerde RAGE-bindende proteïne (EN-RAGE)14. Hoewel we eerder meldden biochemische S100A12-binding aan zowel woede en TLR415, we onlangs aangetoond menselijke monocyten om te reageren op S100A12 stimulatie op een TLR4-afhankelijke manier16. Dit vereist arrangement van S100A12 in zijn CA2 +/Zn2 +-geïnduceerde hexameer Kwartaire structuur16.
Hier beschrijven we een zuiverings procedure voor recombinant humaan S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulaties16,17. Dit is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die in eerste instantie een anion-uitwisselings kolom bevat om het eiwit te isoleren en te concentreren en bulk verontreinigingen te verwijderen (bijv. endotoxinen/lipopolysacchariden)18. Ionenwisselingschromatografie harsen scheiden eiwitten op basis van verschillende netto oppervlakte heffingen. Voor zure eiwitten zoals S100A12 (isoelektrisch punt van 5,81), een buffersysteem met een pH van 8,5 en een sterke anionenwisselingshars leidt tot een goede scheiding. Gebonden eiwitten werden geellueerd met een hoogzout buffer gradiënt. Met een toename van Ionische kracht negatieve ionen in de elutie buffer concurreren met eiwitten voor ladingen op het oppervlak van de hars. Eiwitten individueel Elueer afhankelijk van hun netto-lading en in het resultaat daarvan, de buffers beschreven hierin laten toe om te isoleren en te concentreren de overexpressie S100A12 eiwit. Als gevolg van negatief geladen groepen in lipopolysacchariden, deze moleculen binden ook aan anion-uitwisseling harsen. Echter, hun hogere nettolading resulteert in latere elutie in de toegepaste hoogzout gradiënt. De tweede stap van de zuiverings procedure is ingevoerd voor polijst doeleinden. Dit maakt gebruik van het calcium bindings vermogen van S100A12 en verwijdert achtergebleven onzuiverheden op een hydrofobe-interactie kolom. Calcium binding van S100A12 leidt tot een conformationele verandering en een blootstelling van hydrofobe vlekken op het oppervlak van het eiwit. Op die voorwaarde communiceert S100A12 met het hydrofobe oppervlak van de hars. Bij calcium-chelaat door EDTA wordt deze interactie omgekeerd. In aanwezigheid van ionen, met name calcium en zink, regelt S100A12 de homomerische oligomeren. Om de structuur functie relaties van de verschillende oligomeren te bestuderen, stabiliseerde men dimeric, tetramere en hexameer recombinant S100A12 met een chemische als en scheidde de complexen op een grootte-uitsluitings chromatografie kolom. Tot slot, om de functionaliteit en biologische activiteit van het gezuiverde eiwit en de ionen-geïnduceerde oligomeren te analyseren, kan de cytokine-afgifte van S100A12 en LPS gestimuleerd monocyt worden vergeleken.
Verschillende methoden voor het zuiveren van S100A12 zijn tot nu toe beschreven. Jackson et al.19publiceerde bijvoorbeeld een protocol met zuivering via een anion-uitwisselings kolom en een daaropvolgende grootte-uitsluitings chromatografie. Het polijsten van zuivering op een kolom met grootte uitsluiting leidt tot goede resultaten, maar ― vanwege bijvoorbeeld beperkte laadvolumes ― is minder flexibel in schaalbaarheid. Een andere aanpak, gepubliceerd door Kiss et al.20, beschrijft de zuivering van gelabelde eiwitten via ni2 + affiniteits kolom als de eerste zuiveringsstap, gevolgd door enzymatische splitsing om de tag en verdere zuiveringsstappen te verwijderen. In tegenstelling tot de avooropgestelde studies19,20, wordt het geproduceerde eiwit zoals beschreven in dit protocol bepaald voor experimenten met immuuncellen. Daarom is restant endotoxine besmetting van bacteriële cultuur een uitdaging. Hoewel er tot dusver verschillende benaderingen voor de verwijdering van endotoxine zijn beschreven, is er geen uniforme methode die even goed werkt voor een bepaalde eiwit oplossing21,22.
Kortom, ons protocol combineert de voordelen van een tagvrije expressie in een bacterieel systeem met efficiënte endotoxine verwijdering en hoge opbrengst van zuivere eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we tag-vrije bacteriële expressie van menselijke S100A12 en de zuivering ervan, evenals scheiding in verschillende ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulatie. Vergeleken met gepubliceerde literatuur over S100A12 proteïne zuivering8,23,24, het gebruik van hoge CACL2 (25 mm) in hydrofobe-interactie chromatografie is onze kennis uniek. Verschillende protocollen die concentraties…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door subsidies van het intramurale Innovative Medical Research Program van Muenster University Medical Faculty (KE121201 to C.K.) en de German Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 tot D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
