Mikroinjektion af DNA i øjen knopper i xenopus laevis embryoner og billeddannelse af Gfp udtrykker optiske Axonal Arbors i intakt, levende xenopus Tadpoles
Summary
Denne protokol har til formål at demonstrere, hvordan man mikroinjicere en DNA/dotap blanding i eyebuds af en dag gamle xenopus laevis embryoner, og hvordan man billede og rekonstruere individuelle grønne fluorescerende protein (gfp) udtrykker optiske axonal Dorne i tectal midhjerner af intakt, levende Xenopus Tadpoles.
Abstract
Den primære visuelle projektion af haletudser af vand frøen xenopus laevis fungerer som et glimrende model system til at studere mekanismer, der regulerer udviklingen af neuronal konnektivitet. Under etableringen af Retino-tectal projektion, optiske axoner strækker sig fra øjet og navigere gennem forskellige regioner i hjernen til at nå deres mål væv, optisk tectum. Når optiske axoner ind i tectum, de udførlige Terminal Dorne at funktion til at øge antallet af synaptisk forbindelser, de kan gøre med Target interneuroner i tectum. Her beskriver vi en metode til at udtrykke DNA-kodning grøn fluorescerende protein (GFP), og gevinst-og tab-af-funktion gen konstruktioner, i optiske neuroner (retinal ganglion celler) i Xenopus embryoner. Vi forklarer, hvordan man microinjicere et kombineret DNA/lipofection reagens i øjen knopper af en dag gamle embryoner, således at eksogene gener udtrykkes i enkelt eller lille antal optiske neuroner. Ved at tagge gener med gfp eller co-indsprøjtning med en gfp plasmid, kan Terminal axonal Dorne af individuelle optiske neuroner med ændret Molekylær signalering imælges direkte i hjerner af intakt, levende xenopus haletudser flere dage senere, og deres morfologi kan kvantificeres. Denne protokol giver mulighed for bestemmelse af celle-autonome molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af optisk Axon arborization in vivo.
Introduction
Under udviklingen af nervesystemet, axoner af præsynaptiske neuroner navigere gennem forskellige regioner i hjernen til at nå deres mål områder. Når axoner invaderer deres målvæv, de etablerer synaptiske forbindelser med postsynaptiske Target neuroner. I mange typer af neuroner øger axoner antallet og den rumlige udstrækning af synaptiske forbindelser, de kan gøre ved at udarbejde netværk af Terminal grene eller Dorne1. Retino-tectal projektion af tadpoler af vand frøen xenopus laevis er en stærk hvirveldyr model for undersøgelse af mekanismer underliggende Terminal Axon arborization og synaptisk tilslutningsmuligheder2,3,4 . Individuelle gfp udtrykker optiske axonal Dorne med normal og ændret Molekylær signalering kan observeres direkte i intakt, levende xenopus haletudser5,6,7,8. For at udtrykke GFP alene eller sammen med fuld længde eller trunkerede versioner af gener i et lille antal optiske neuroner, bruger vi en teknik, der involverer mikroinjektion/lipofection af DNA i eyebuds af en dag gamle Xenopus embryoner9, 10. denne teknik blev oprindeligt udviklet til at studere mekanismer af optisk Axon pathfinding i unge xenopus Tadpoles, og er siden blevet anvendt af os og andre til at bestemme celle-autonome molekylære mekanismer underliggende optisk Axon arborisering i xenopus haletudser5,6,7,8,9,10.
Alternative teknikker til at udtrykke eksogene gener i et lille antal optiske neuroner er blevet udviklet i andre model arter, samt i X. laevis. Men hver af disse tilgange præsenterer udfordringer og begrænsninger i forhold til mikroinjektion af DNA/lipofection reagens i øjen knopper af Xenopus embryoner. I mus kan transgenese bruges til at udtrykke gener i et lille antal optiske neuroner, men genereringen af Transgene mus er bekostelig og tidskrævende og Transgene mus ofte til stede med uønskede bivirkninger11. Transgene zebra, der udtrykker eksogene gener i optiske neuroner kan også skabes ved at injicere plasmider i tidlige kavaler stadiet embryoner12. Denne proces kræver imidlertid kloning af en specifik promotor for at udtrykke gener i et mosaik mønster i optiske neuroner i Zebra larver12. Hyppigheden af ekspression af eksogen DNA i optiske neuroner i transgene Zebra er også noget lavere (< 30%) sammenlignet med xenopus haletudser, der blev mikroinjiceret med DNA/liposomal reagens (30 − 60%)12. I ovo elektroporation er også blevet brugt til at udtrykke gener i et lille antal optiske neuroner i kyllinger13. Men denne procedure har undladt fuldt ud at karakterisere mekanismer, der etablerer optiske fremskrivninger, fordi optisk Axon arborization ikke kan afbildet i intakt, levende chick embryoner. Endelig har flere laboratorier brugt elektroporation til transficere gener i et lille antal optiske neuroner i xenopus haletudser14,15. Men elektro poration kræver optimering af udstyr og protokoller (stimulator, elektroder, rumlige og tidsmæssige mønstre af bølge impulser) ud over, der anvendes til mikroinjektion af DNA/lipofection reagens i øjen knopper af Xenopus embryoner.
Vi og andre tidligere brugte teknikken med mikroinjektion/lipofection af DNA i øjen knopper af xenopus embryoner til at bestemme celle autonome signalerings mekanismer, der etablerer optisk Axon arborization5,6, 7 , 8. vi brugte oprindeligt denne fremgangsmåde til at dissekere funktionerne i cadherin og WNT adapter protein β-køreledning i optisk axonal arborisering i xenopus haletudser5,6. I en undersøgelse viste vi, at β-køreledning i binding til α-køreledning i og til PDZ er påkrævet for henholdsvis at initiere og forme optiske axonal Dorne in vivo5. I en anden rapport demonstrerede vi, at β-køreledningen i bindende domæner for α-køreledning i og GSK-3β i modsætning hertil modulerede projektions mønstre af ventrale optiske axonal Dorne6. For nylig, vi identificerede roller for WNT faktor, adenomatøs poliposis coli (APC), i reguleringen morfologiske funktioner af optiske axonal Dorne i xenopus haletudser7. Ved at co-udtrykke N-terminalen og centrale domæner i APC, at moduere β-køreledning i stabilitet og mikrotubulus organisation sammen med gfp i individuelle optiske neuroner, vi fastsatte delte og særskilte roller for disse APC interaktion domæner på filial nummer, længde, og vinkel i optiske axonal Dorne in vivo7. Et andet laboratorium anvendte mikroinjektion/lipofection teknik til at bestemme celle autonome roller for signalering af BDNF receptor, TrkB, i optiske axonal Dorne i xenopus haletudser8. Denne gruppe viste, at udtryk for en dominerende-negativ TrkB rystet forgrening og synaptisk modning i individuelle optiske Axon Dorne in vivo8. Samlet set har lipofection-teknikken i Xenopus allerede belyst de specifikke roller for forskellige gener i optisk Axon-forgrenings forgrening i det indfødte miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel demonstrerer vi, hvordan man udtrykker eksogene DNA-konstruktioner i enkelt eller lille antal optiske neuroner, og hvordan man billede individuelle gfp udtrykker optiske axonal Dorne med normal og ændret Molekylær signalering i intakte, levende tadpoler af frøen X . laevis. Vi forklarer også, hvordan man rekonstruere og kvantificere morfologien af gfp udtrykker optiske axonal Dorne fra billeder fanget in vivo. For at udtrykke eksogene DNA-plasmider i et lille antal optiske neuroner, mikroinji…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Touro University California College for osteopatisk medicin for at støtte vores forskning. Vi anerkender tidligere studerende i laboratoriet (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John lim), der hjalp med at implementere denne mikroinjektionsteknik i vores laboratorium. Vi er taknemmelig for Dr. Christine Holt, i hvis laboratorium denne DNA mikroinjektion/lipofection teknik i Xenopus embryoner blev først udviklet.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
