Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles
Summary
Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.
Abstract
La proiezione visiva primaria dei girini della rana acquatica Xenopus laevis serve come un eccellente sistema modello per studiare i meccanismi che regolano lo sviluppo della connettività neuronale. Durante la creazione della proiezione retino-tectale, gli assoni ottici si estendono dall’occhio e navigano attraverso regioni distinte del cervello per raggiungere il loro tessuto bersaglio, il tectum ottico. Una volta che gli assoni ottici entrano nel tectum, elaborano arbori terminali che funzionano per aumentare il numero di connessioni sinaptiche che possono fare con interneuroni bersaglio nel tectum. Qui, descriviamo un metodo per esprimere il DNA che codifica la proteina fluorescente verde (GFP), e i costrutti genici di guadagno e perdita di funzione, nei neuroni ottici (cellule gangliari retiniche) negli embrioni di Xenopo. Spieghiamo come microinietare un reagente combinato DNA/lipofection in bulbi oculari di embrioni vecchi di un giorno in modo tale che i geni esogeni siano espressi in un numero singolo o piccolo di neuroni ottici. Etichettando i geni con GFP o co-iniettando con un plasmide GFP, gli arbori assonali terminali di singoli neuroni ottici con segnalazione molecolare alterata possono essere immagine direttamente nel cervello di girini Dello Xenopo intatti diversi diversi diversi diversi giorni dopo, e la loro morfologia può essere quantificato. Questo protocollo consente la determinazione di meccanismi molecolari auto-autonomi alla base dello sviluppo dell’arborizzazione ottica degli assoni in vivo.
Introduction
Durante lo sviluppo del sistema nervoso, assoni di neuroni pressinaptici navigare attraverso diverse regioni del cervello per raggiungere le loro aree di destinazione. Quando gli assoni invadono i loro tessuti bersaglio, stabiliscono connessioni sinaptiche con neuroni bersaglio postsinaptici. In molti tipi di neuroni, gli assoni aumentano il numero e l’estensione spaziale delle connessioni sinaptiche che possono effettuare elaborando reti di rami terminali o arbori1. La proiezione retino-tectale dei girini della rana acquatica Xenopus laevis è un potente modello vertebrato per esaminare i meccanismi alla base dell’arborizzazione degli assoni terminali e della connettività sinaptica2,3,4 . I singoli pergolato assonali ottici che esprimono pergolato ottico con segnalazione molecolare normale e alterata possono essere osservati direttamente in giri di Xenopus intatti, viventi 5,6,7,8. Per esprimere gFP da solo o insieme a versioni a lunghezza intera o troncate di geni in un piccolo numero di neuroni ottici, utilizziamo una tecnica che coinvolge microiniezione / lipofezione di DNA in boccioli di un giorno vecchi embrioni Xenopi 9, 10. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata per studiare i meccanismi di ricerca del percorso degli assoni ottici nei giovani girini Xenopus, e da allora è stata applicata da noi e da altri per determinare i meccanismi molecolari autonomi delle cellule alla base dell’assone ottico arborizzazione in girini Dienopus 5,6,7,8,9,10.
Tecniche alternative per esprimere geni esogeni in un piccolo numero di neuroni ottici sono stati sviluppati in altre specie modello, così come in X. laevis. Tuttavia, ognuno di questi approcci presenta sfide e limitazioni rispetto alla microiniezione di DNA/lipofection reagente in eyebuds di embrioni Xenopus. Nei topi, la transgenesi può essere utilizzata per esprimere geni in un piccolo numero di neuroni ottici, ma la generazione di topi transgenici è costosa e richiede tempo e topi transgenici spesso presentano effetti collaterali indesiderati11. Il pesce zebra transgenico che esprime geni esogeni nei neuroni ottici può anche essere creato iniettando plasmidi negli embrioni dello stadio di scissione precoce12. Tuttavia, questo processo richiede la clonazione di un promotore specifico per esprimere i geni in un modello a mosaico nei neuroni ottici nelle larve del pesce zebra12. Anche la frequenza di espressione del DNA esogeno nei neuroni ottici nei pesci zebra transgenici è leggermente inferiore (<30%) rispetto ai girini di Xenopus che sono stati microiniettati con reagente di DNA/liposomal (30-60%)12. Nell’elettroporazione ovocale è stato utilizzato anche per esprimere i geni in un piccolo numero di neuroni ottici nei pulcini13. Tuttavia, questa procedura non è riuscita a caratterizzare completamente i meccanismi che stabiliscono proiezioni ottiche perché l’arborizzazione ottica degli assoni non può essere immagine in embrioni di pulcino vivi e intatti. Infine, diversi laboratori hanno utilizzato l’elettroporazione per trasfecare i geni in un piccolo numero di neuroni ottici nei girini di Xenopus 14,15. Tuttavia, l’elettroporazione richiede l’ottimizzazione di apparecchiature e protocolli (stimolatore, elettrodi, modelli spaziali e temporali di impulsi d’onda) oltre a quello utilizzato per la microiniezione di DNA/lipofezione in boccioli di embrioni Xenopi.
Noi e altri in precedenza abbiamo usato la tecnica di microiniezione/lipofezione del DNA in orbite di embrioni di Xenopus per determinare i meccanismi di segnalazione autonoma cellulare che stabiliscono l’arborizzazione ottica assonale5,6, 7 (in questo stato , 8. Inizialmente abbiamo utilizzato questo approccio per sezionare le funzioni della proteina-catenina dell’adattatore Cadherin e Wnt nella arborizzazione assonale ottica nei girini di Xenopus 5,6. In uno studio, abbiamo mostrato che è richiesto il legame di catenina a z-catenina e pd, rispettivamente, per l’iniazione e la forma di arbori assonali ottici in vivo5. In un secondo rapporto, abbiamo dimostrato che i domini vincolanti di catenina z per la f-catenina e GSK-3 – modulano in modo opposto i modelli di proiezione degli arbori assonali ottici ventrali6. Più recentemente, abbiamo identificato ruoli per il fattore Wnt, adenomatous poliposis coli (APC), nella regolazione delle caratteristiche morfologiche degli arbori assonali ottici nei giri loschi xenopi 7. Esprimendo il N-terminale e i domini centrali di APC che modulano la stabilità della catenina e l’organizzazione dei microtubuli insieme a GFP nei singoli neuroni ottici, abbiamo determinato ruoli condivisi e distinti per questi domini di interazione APC sul numero di filiale, lunghezza e angolo in pergolato assonale ottico in vivo7. Un altro laboratorio ha utilizzato la tecnica di microiniezione/lipofection per determinare i ruoli autonomi delle cellule per la segnalazione da parte del recettore BDNF, TrkB, in perimeri assonali ottici nei giri xenopi 8. Questo gruppo ha mostrato che l’espressione di una maturazione perturbato TrkB dominante-negativo e maturazione sinaptica nei singoli arbori ottici in vivo8. Nel complesso, la tecnica di lipofezione in Xenopus ha già illuminato i ruoli specifici di diversi geni nella ramificazione ottica degli assoni nell’ambiente nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, dimostriamo come esprimere costrutti di DNA esogeni in singoli o piccoli tipi di neuroni ottici e come immaginare singoli arbori assonali ottici che esprimono arbori assonali ottici con segnalazioni molecolari normali e alterate in tapole intatte e viventi della rana X . lave. Spieghiamo anche come ricostruire e quantificare la morfologia di GFP esprimendo arbori assonali ottici da immagini catturate in vivo. Per esprimere plasmidi di DNA esogeno in piccoli numeri di neuroni ottici, microinie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo touro University California College of Osteopathic Medicine per aver sostenuto la nostra ricerca. Riconosciamo gli studenti precedenti in laboratorio (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) che hanno contribuito a implementare questa tecnica di microiniezione nel nostro laboratorio. Siamo grati alla dott.ssa Christine Holt, nel cui laboratorio è stata sviluppata per la prima volta questa tecnica di microiniezione/lipofezione del DNA negli embrioni di Xenopus.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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