Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles
Summary
Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d’embryons de Xenopus laevis d’un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.
Abstract
La projection visuelle primaire des têtards de la grenouille aquatique Xenopus laevis sert d’excellent système modèle pour étudier les mécanismes qui régulent le développement de la connectivité neuronale. Pendant l’établissement de la projection rétino-tectal, les axones optiques s’étendent de l’oeil et naviguent par des régions distinctes du cerveau pour atteindre leur tissu cible, le tectum optique. Une fois que les axones optiques entrent dans le tectum, ils élaborent des arborescences terminales qui fonctionnent pour augmenter le nombre de connexions synaptiques qu’ils peuvent faire avec les interneurons cibles dans le tectum. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer l’ADN codant la protéine fluorescente verte (GFP), et le gain- et la perte-de-fonction des constructions de gène, dans les neurones optiques (cellules de ganglion rétinien) dans les embryons de Xenopus. Nous expliquons comment microinjecter un réagent combiné d’ADN/lipofection dans des bourgeons oculaires des embryons d’un jour de sorte que les gènes exogènes soient exprimés dans un nombre simple ou petit de neurones optiques. En étiquetant les gènes avec GFP ou en co-injectant avec un plasmique GFP, les arborescences axonales terminales des neurones optiques individuels avec la signalisation moléculaire altérée peuvent être représentés directement dans les cerveaux des têtards Xenopus intacts et vivants plusieurs jours plus tard, et leur morphologie peut être quantifiée. Ce protocole permet de déterminer les mécanismes moléculaires autonomes des cellules qui sous-tendent le développement de l’arborescence optique des axones in vivo.
Introduction
Pendant le développement du système nerveux, les axones des neurones presynaptiques naviguent à travers diverses régions du cerveau pour atteindre leurs zones cibles. Lorsque les axones envahissent leurs tissus cibles, ils établissent des connexions synaptiques avec les neurones cibles postsynaptiques. Dans de nombreux types de neurones, les axones augmentent le nombre et l’étendue spatiale des connexions synaptiques qu’ils peuvent faire en élaborant des réseaux de branches terminales ou d’arborescences1. La projection rétino-tectale des têtards de la grenouille aquatique Xenopus laevis est un puissant modèle vertébré pour l’examen des mécanismes sous-jacents à l’arboriculture terminale axon et à la connectivité synaptique2,3,4 . GFP individuel exprimant des arborescences axonales optiques avec la signalisation moléculaire normale et altérée peut être observé directement dans intact, vivant tadpoles de Xenopus 5,6,7,8. Pour exprimer GFP seul ou avec des versions pleine longueur ou tronquées de gènes dans un petit nombre de neurones optiques, nous utilisons une technique impliquant la microinjection / lipofection de l’ADN dans les bourgeons oculaires d’un jour vieux embryons Xenopus 9, 10. Cette technique a été développée à l’origine pour étudier des mécanismes de releveur optique d’axone dans de jeunes têtards de Xenopus, et a depuis été appliquée par nous et d’autres pour déterminer les mécanismes moléculaires cellulaires-autonomes sous-jacents à l’axon optique arborisation dans les têtards Xenopus 5,6,7,8,9,10.
D’autres techniques d’expression des gènes exogènes dans un petit nombre de neurones optiques ont été développées chez d’autres espèces modèles, ainsi que chez X. laevis. Cependant, chacune de ces approches présente des défis et des limitations par rapport à la microinjection de réagent d’ADN/lipofection dans les oculaires des embryons de Xenopus. Chez la souris, la transgenèse peut être utilisée pour exprimer des gènes dans un petit nombre de neurones optiques, mais la génération de souris transgéniques est coûteuse et longue et les souris transgéniques présentent souvent des effets secondaires indésirables11. Le poisson zèbre transgénique qui exprime des gènes exogènes dans les neurones optiques peut également être créé en injectant des plasmides dans les embryons de stade de clivage précoce12. Cependant, ce processus exige le clonage d’un promoteur spécifique pour exprimer des gènes dans un modèle de mosaïque dans les neurones optiques dans les larves de poissons zèbres12. La fréquence d’expression de l’ADN exogène dans les neurones optiques chez le poisson zèbre transgénique est également un peu plus faible (lt;30%) par rapport aux têtards Xenopus qui ont été microinjectés avec de l’ADN/réactif liposomal (30 à 60 %)12. Dans ovo électroporation a également été utilisé pour exprimer les gènes dans un petit nombre de neurones optiques chez les poussins13. Cependant, cette procédure n’a pas réussi à caractériser complètement les mécanismes qui établissent des projections optiques parce que l’arboriculture d’axone optique ne peut pas être imagedans intact, embryons de poussins vivants. Enfin, plusieurs laboratoires ont utilisé l’électroporation pour transfect gènes dans un petit nombre de neurones optiques dans les têtards Xenopus 14,15. Pourtant, l’électroporation nécessite l’optimisation de l’équipement et des protocoles (stimulateur, électrodes, schémas spatiaux et temporels des impulsions d’ondes) au-delà de celui utilisé pour la microinjection d’ADN/réagent de lipofection dans les oculaires des embryons xenopus.
Nous et d’autres précédemment utilisé la technique de microinjection / lipofection de l’ADN dans les bourgeons oculaires des embryons Xenopus pour déterminer les mécanismes de signalisation autonome scellule qui établissent l’arboriculture d’axone optique5,6, 7 Annonces , 8. Nous avons d’abord utilisé cette approche pour disséquer les fonctions de la protéine d’adaptateur Cadherin et Wnt- caténine dans l’arboriculture axonale optique dans les têtards Xenopus 5,6. Dans une étude, nous avons montré que la liaison de la caténine à la caténine et à la PDZ est nécessaire, respectivement, pour lancer et façonner des arbres axonaux optiques in vivo5. Dans un deuxième rapport, nous avons démontré que les domaines de liaison de la caténine pour la caténine et gsk-3 modulent en contrepartie les modèles de projection des arborescences axonales optiques ventrales6. Plus récemment, nous avons identifié des rôles pour le facteur Wnt, adénomatous poliposis coli (APC), dans la régulation des caractéristiques morphologiques des arborescences axonales optiques dans les têtards Xenopus 7. En co-exprimant les domaines N-terminal et central d’APC qui modulent la stabilité et l’organisation de la caténine et de la microtubule avec GFP dans les neurones optiques individuels, nous avons déterminé des rôles partagés et distincts pour ces domaines d’interaction APC sur le nombre de succursales, longueur, et l’angle dans les arborescences axonales optiques in vivo7. Un autre laboratoire a utilisé la technique de microinjection/lipofection pour déterminer les rôles autonomes cellulaires pour la signalisation par le récepteur BDNF, TrkB, dans les arborescences axonales optiques dans les têtards Xenopus 8. Ce groupe a montré que l’expression d’une branchement et de maturation synaptique perturbée par trkB dominant-négatif dans les arborescences individuelles d’axone optique in vivo8. Dans l’ensemble, la technique de lipofection dans Xenopus a déjà illuminé les rôles spécifiques de différents gènes dans la ramification d’axone optique dans l’environnement indigène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous démontrons comment exprimer les constructions exogènes d’ADN dans un nombre simple ou petit de neurones optiques et comment imager les GFP individuels exprimant les arborescences axonales optiques avec la signalisation moléculaire normale et modifiée dans intact, têtards vivants de la grenouille X . laevis. Nous expliquons également comment reconstruire et quantifier la morphologie de GFP exprimant des arborescences axonales optiques à partir d’images capturées in vivo. Pour exprim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Touro University California College of Osteopathic Medicine d’avoir soutenu notre recherche. Nous rendons hommage aux anciens étudiants du laboratoire (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) qui ont participé à la mise en œuvre de cette technique de microinjection dans notre laboratoire. Nous sommes reconnaissants à la Dre Christine Holt, dont le laboratoire a développé cette technique de microinjection/lipofection de l’ADN chez les embryons Xenopus.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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