Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles
Summary
Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo’s, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.
Abstract
De primaire visuele projectie van kikkers van de aquatische kikker Xenopus laevis fungeert als een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van mechanismen die de ontwikkeling van neuronale connectiviteit reguleren. Tijdens de oprichting van de retino-tectal projectie, strekken de optische axonen zich uit het oog en navigeren door verschillende hersengebieden om hun doelweefsel, de optiek Tectum, te bereiken. Zodra de optiek axonen het Tectum betreden, werken ze met Terminal Arbors die functioneren om het aantal synaptische verbindingen te verhogen dat ze kunnen maken met doel-interneuronen in het Tectum. Hier beschrijven we een methode voor het uitdrukken van DNA-codering groene fluorescerende eiwitten (GFP), en winst-en verlies-van-functie-genconstructies, in optische neuronen (retinale ganglioncellen) in Xenopus -embryo’s. We leggen uit hoe een gecombineerd DNA/lipofection-reagens microinjecteert in de oogtoppen van een dag oude embryo’s, zodat exogene genen worden uitgedrukt in enkele of kleine aantallen optische neuronen. Door genen te taggen met GFP of co-injecteren met een GFP plasmide, kunnen terminale axonale Arbors van individuele optische neuronen met veranderde moleculaire signalering direct worden afgebeeld in de hersenen van intact, levende Xenopus kikkers enkele dagen later, en hun morfologie kunnen worden gekwantificeerd. Dit protocol maakt het mogelijk om cel-autonome moleculaire mechanismen te bepalen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van optische axon-arboriisatie in vivo.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel navigeren axonen van presynaptische neuronen door verschillende hersengebieden om hun doelgebieden te bereiken. Wanneer axonen hun doelweefsels binnendringen, vestigen ze synaptische verbindingen met postsynaptische doel neuronen. In vele soorten neuronen, axonen verhogen het aantal en ruimtelijke omvang van synaptische verbindingen die ze kunnen maken door het uitwerken van netwerken van Terminal takken of Arbors1. De retino-tectal projectie van kikkers van de aquatische kikker Xenopus laevis is een krachtig gewervelde model voor het onderzoeken van mechanismen onderliggende terminale axon-arboriisatie en synaptische connectiviteit2,3,4 . Individuele GFP uitdrukken optische axonale Arbors met normale en veranderde moleculaire signalering kan direct worden waargenomen in intact, levende Xenopus kikkers5,6,7,8. Om GFP alleen of in combinatie met volledige of afgeknotte versies van genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken, gebruiken we een techniek waarbij Microinjection/lipofectie van DNA wordt gebruikt in eyebuds van een dag oude Xenopus -embryo’s9, 10. deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld om mechanismen van optische axon padvinden te bestuderen in jonge Xenopus tadpoles, en is sindsdien door ons en anderen toegepast om cel-autonome moleculaire mechanismen onderliggende optische axon te bepalen arborisatie in Xenopus kikkers5,6,7,8,9,10.
Alternatieve technieken om exogene genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken zijn ontwikkeld in andere model soorten, evenals in X. laevis. Echter, elk van deze benaderingen presenteert uitdagingen en beperkingen in vergelijking met micro injectie van DNA/lipofection reagens in de oogtoppen van Xenopus embryo’s. Bij muizen kan Transgenese worden gebruikt om genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken, maar de generatie van transgene muizen is duur en tijdrovend en transgene muizen zijn vaak aanwezig met ongewenste neveneffecten11. Transgene zebravis die exogene genen in optische neuronen uitdrukken, kan ook worden gecreëerd door plasmiden te injecteren in vroeg splijter stadium embryo’s12. Dit proces vereist echter klonen van een specifieke promotor om genen uit te drukken in een mozaïek patroon in oogzenuw cellen in larven van zebravis12. De frequentie van expressie van exogeen DNA in optische neuronen in transgene zebravis is ook iets lager (< 30%) vergeleken met Xenopus kikkers die microgeïnjecteerd waren met DNA/liposomaal reagens (30 − 60%)12. In OVO is elektroporation ook gebruikt om genen in kleine aantallen optische neuronen in kuikens13uit te drukken. Echter, deze procedure is niet volledig karakteriseren mechanismen die optische projecties vast te stellen, omdat optiek axon arborization niet kan worden afgebeeld in intact, levende Chick embryo’s. Tot slot hebben verschillende laboratoria elektroporation gebruikt om genen te transfect in een klein aantal optische neuronen in Xenopus kikkers14,15. Toch vereist elektroporation optimalisatie van apparatuur en protocollen (stimulator, elektroden, ruimtelijke en temporele patronen van Golf pulsen) dan die gebruikt voor micro injectie van DNA/lipofection reagens in de oogtoppen van Xenopus embryo’s.
Wij en anderen gebruikten eerder de techniek van Microinjection/lipofectie van DNA in de eyebuds van Xenopus -embryo’s om cel autonome signalerings mechanismen te bepalen die optische axon-arborization5,6, 7 , 8. in eerste instantie gebruikten we deze aanpak om de functies van de cadherin en WNT adaptor proteïne β-bovenarm in de optische axonale arboriisatie in Xenopus kikkers5,6te ontleden. In een studie toonden we aan dat β-bovendeel binding aan α-bovendeel en aan PDZ respectievelijk vereist is voor het initiëren en vorm geven van optische axonale Arbors in vivo5. In een tweede rapport lieten we zien dat de β-Bovenkabel in bindings gebieden voor α-bovendeel en GSK-3β-tegengesteld moduleren projectie patronen van ventrale optische axonale Arbors6. Meer recentelijk, we geïdentificeerd rollen voor de Wnt factor, adenomateuze poliposis coli (APC), bij het reguleren van de morfologische kenmerken van optische axonale Arbors in Xenopus kikkers7. Door de N-Terminal en de centrale domeinen van de APC, die β-bovenlijnen in stabiliteit en microtubulus samen met GFP in individuele optiek neuronen moduleren, gezamenlijk uit te drukken, hebben we gedeelde en duidelijke rollen vastgesteld voor deze APC-interactie domeinen op het filiaalnummer, lengte en hoek in optische axonale Arbors in vivo7. Een ander laboratorium gebruikt de Microinjection/lipofection-techniek om cel autonome rollen te bepalen voor signalering door de BDNF-receptor, trkb, in optische axonale Arbors in Xenopus kikkers8. Deze groep toonde aan dat expressie van een dominante-negatieve trkb verontrust vertakkingen en synaptische rijping in individuele optische axon Arbors in vivo8. Over het algemeen heeft de lipofection-techniek in Xenopus al de specifieke rollen van verschillende genen in optiek axon vertakkingen in de inheemse omgeving verlicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel laten we zien hoe u exogene DNA-constructies in enkele of kleine aantallen optische neuronen uitdrukt en hoe u afzonderlijke GFP-uitbeeldende optische axonale Arbors met normale en veranderde moleculaire signalering in intact, levende kikkers van de kikker X . laevis. We leggen ook uit hoe we de morfologie van GFP, die optische axonale Arbors uitdrukt, van beelden die in vivo zijn vastgelegd, kunnen reconstrueren en kwantificeren. Om exogene DNA-plasmiden uit te drukken in een klein aantal optisch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Touro University California College voor osteopathische geneeskunde voor het ondersteunen van ons onderzoek. We erkennen eerdere studenten in het laboratorium (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) die geholpen hebben bij de implementatie van deze micro Injection-techniek in ons laboratorium. We zijn dankbaar voor Dr. Christine Holt, in wiens laboratorium deze DNA-Microinjection/lipofection-techniek in Xenopus -embryo’s voor het eerst werd ontwikkeld.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
