Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles
Summary
Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.
Abstract
Die primäre visuelle Projektion von Kaulquappen des Wasserfrosches Xenopus laevis dient als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung neuronaler Konnektivität regulieren. Bei der Etablierung der retino-tektalen Projektion erstrecken sich optische Axone vom Auge aus und navigieren durch verschiedene Regionen des Gehirns, um ihr Zielgewebe, das optische Tectum, zu erreichen. Sobald optische Axone in das Tectum eindringen, erarbeiten sie Klemmenlaube, die die Anzahl der synaptischen Verbindungen erhöhen, die sie mit Zielinterneuronen im Tectum herstellen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Exodierung von DNA-Kodierung von grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und Gain- und Verlust-von-Funktions-Genkonstrukte in optischen Neuronen (retinalen Ganglienzellen) in Xenopus-Embryonen. Wir erklären, wie man ein kombiniertes DNA/Lipofection-Reagenz in Augenknospen von eintägigen Embryonen mikroinjiziert, so dass exogene Gene in einer oder einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen exprimiert werden. Durch Taggen mit GFP oder Co-Injektion mit einem GFP-Plasmid können terminale axonale Arbors einzelner optischer Neuronen mit veränderter molekularer Signalisierung direkt in Gehirnen intakter, lebender Xenopus-Kaulquappen einige Tage später und deren Morphologie abgebildet werden. quantifiziert werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht die Bestimmung zellautonomer molekularer Mechanismen, die der Entwicklung der optischen Axonarborisation in vivo zugrunde liegen.
Introduction
Während der Entwicklung des Nervensystems navigieren Axone von präsynaptischen Neuronen durch verschiedene Regionen des Gehirns, um ihre Zielbereiche zu erreichen. Wenn Axone in ihr Zielgewebe eindringen, stellen sie synaptische Verbindungen mit postsynaptischen Zielneuronen her. In vielen Arten von Neuronen erhöhen Axone die Anzahl und räumliche Ausdehnung der synaptischen Verbindungen, diesie durch die Ausarbeitung von Netzwerken von Terminalzweigen oder Lauben 1 herstellen können. Die retinotektale Projektion von Kaulquappen des Wasserfrosches Xenopus laevis ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell zur Untersuchung von Mechanismen, die der terminalen Axonarborisation und synaptischen Konnektivität zugrunde liegen2,3,4 . Individuelle GFP-Exzessionen mit optischen axonalen Lauben mit normaler und veränderter molekularer Signalisierung können direkt in intakten, lebenden Xenopus-Kaulquappen 5,6,7,8beobachtet werden. Um GFP allein oder zusammen mit in voller Länge oder abgeschnittenen Versionen von Genen in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, verwenden wir eine Technik, bei der die Mikroinjektion/Lipofection von DNA in Augenknospen von eintägigen Xenopus-Embryonen 9, 10. Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um Mechanismen der optischen Axon-Pfadfindung in jungen Xenopus-Kaulquappen zu untersuchen, und wurde seitdem von uns und anderen angewendet, um zellautonome molekulare Mechanismen zu bestimmen, die dem optischen Axon zugrunde liegen. Arborisation in Xenopus Kaulquappen5,6,7,8,9,10.
Alternative Techniken zur Exjegung exogener Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen wurden in anderen Modellarten sowie in X. laevisentwickelt. Jeder dieser Ansätze stellt jedoch Herausforderungen und Einschränkungen dar, wenn man sie mit der Mikroinjektion von DNA/Lipofektionsreagenz in Augenknospen von Xenopus-Embryonen vergleicht. Bei Mäusen kann die Transgenese verwendet werden, um Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, aber die Erzeugung von transgenen Mäusen ist teuer und zeitaufwändig und transgene Mäuse sind oft mit unerwünschten Nebenwirkungen vorhanden11. Transgene Zebrafische, die exogene Gene in optischen Neuronen ausdrücken, können auch durch Injektion von Plasmiden in Embryonen im frühen Spaltungsstadium12entstehen. Dieser Prozess erfordert jedoch das Klonen eines bestimmten Promotors, um Gene in einem Mosaikmuster in optischen Neuronen in Zebrafischlarvenauszudrücken 12. Die Expressionshäufigkeit exogener DNA in optischen Neuronen bei transgenen Zebrafischen ist ebenfalls etwas geringer (<30%) im Vergleich zu Xenopus-Kaulquappen, die mit DNA/liposomalem Reagenz mikroinjiziert wurden (30 bis 60%)12. In ovo Elektroporation wurde auch verwendet, um Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen in Kükenauszudrücken 13. Dieses Verfahren hat jedoch nicht die Mechanismen vollständig charakterisiert, die optische Projektionen herstellen, da die optische Axonarborisation nicht in intakten, lebenden Kükenembryonen abgebildet werden kann. Schließlich haben mehrere Laboratorien Elektroporation verwendet, um Gene in eine kleine Anzahl von optischen Neuronen in Xenopus Kaulquappen14,15zu transfekieren. Dennoch erfordert die Elektroporation eine Optimierung der Ausrüstung und Protokolle (Stimulator, Elektroden, räumliche und zeitliche Muster von Wellenimpulsen) über die für die Mikroinjektion von DNA/Lipofektionreagenz in Augenknospen von Xenopus-Embryonen verwendeten Daten.
Wir und andere haben zuvor die Technik der Mikroinjektion/Lipofektion von DNA in Augenknospen von Xenopus-Embryonen verwendet, um zellautonome Signalmechanismen zu bestimmen, die eine optische Axonarborisation 5,6, 7 , 8. Diesen Ansatz haben wir zunächst verwendet, um die Funktionen des Cadherin- und Wnt-Adapterproteins in der optischen axonalen Arborisierung in Xenopus-Kaulquappen 5,6zu sezieren. In einer Studie zeigten wir, dass die Bindung von ‘-Catenin an ‘-Catenin bzw. an PDZ für die Initiierung und Formgebung optischer axonaler Lauben in vivo5erforderlich ist. In einem zweiten Bericht haben wir gezeigt, dass die Bindungsdomänen für die A-Catenin- und GSK-3-Bindungsmuster von ventralen optischen axonalen Arbors6. In jüngerer Zeit haben wir Rollen für den Wnt-Faktor, adenomatous poliposis coli (APC), bei der Regulierung morphologischer Merkmale von optischen axonalen Lauben in Xenopus Kaulquappen7identifiziert. Durch die Ko-Exjekierung der N-Terminal und zentrale Domänen von APC, die die Organisation von A-Catenin-Stabilität und Mikrotubuli zusammen mit GFP in einzelnen optischen Neuronen modulieren, haben wir gemeinsame und unterschiedliche Rollen für diese APC-Interaktionsdomänen auf Zweignummer bestimmt. Länge und Winkel in optischen axonalen Lauben in vivo7. Ein anderes Labor verwendete die Mikroinjektions-/Lipofektionstechnik, um zellautonome Rollen für die Signalisierung durch den BDNF-Rezeptor TrkB in optischen axonalen Lauben in Xenopus Kaulquappen8zu bestimmen. Diese Gruppe zeigte, dass die Expression einer dominant-negativen TrkB gestörtverzweigte Verzweigung und synaptische Reifung in einzelnen optischen Axon-Arbors in vivo8. Insgesamt hat die Lipofektionstechnik in Xenopus bereits die spezifischen Rollen verschiedener Gene bei der optischen Axonverzweigung in der nativen Umgebung beleuchtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel zeigen wir, wie man exogene DNA-Konstrukte in einer oder einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen ausdrückt und wie man einzelne GFP-Ausdrücke von optischen axonalen Lauben mit normaler und veränderter molekularer Signalisierung in intakten, lebenden Kaulquappen des Frosches X . laevis. Wir erklären auch, wie die Morphologie des GFP zu rekonstruieren und zu quantifizieren, die optische axonale Lauben aus Bildern ausdrückt, die in vivo aufgenommen wurden. Um exogene DNA-Plasmide in einer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Touro University California College of Osteopathic Medicine für die Unterstützung unserer Forschung. Wir würdigen frühere Studenten im Labor (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim), die bei der Implementierung dieser Mikroinjektionstechnik in unserem Labor geholfen haben. Wir danken Dr. Christine Holt, in deren Labor diese DNA-Mikroinjektions-/Lipofektionstechnik in Xenopus-Embryonen zum ersten Mal entwickelt wurde.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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