Microinjection av DNA i Eyebuds i Xenopus laevis embryo og IMAGING av GFP uttrykke optikk axonal arbors i intakt, Living Xenopus rumpetroll
Summary
Denne protokollen har som mål å demonstrere hvordan man microinject en DNA/DOTAP blanding i eyebuds av en dag gamle Xenopus laevis embryo, og hvordan å image og rekonstruere individuelle grønne fluorescerende PROTEIN (GFP) uttrykker optikk axonal arbors i tectal midbrains av intakt, levende Xenopus rumpetroll.
Abstract
Den primære visuelle projeksjon av rumpetroll av akvatiske frosken Xenopus laevis fungerer som et utmerket modell system for å studere mekanismer som regulerer utviklingen av neuronal tilkobling. Under etablering av retino-tectal projeksjon, optikk axons strekker seg fra øyet og navigere gjennom forskjellige regioner av hjernen for å nå sine mål vev, den optiske tectum. En gang optisk axons Gå inn det tectum, de utdype Terminal arbors det funksjonen å forhøye antallet av Synaptic forbindelser de kanne lage med mål interneurons inne det tectum. Her beskriver vi en metode for å uttrykke DNA-koding grønt fluorescerende protein (GFP), og få-og tap-of-Function genet konstruerer, i optiske neurons (retinal Ganglion celler) i Xenopus embryo. Vi forklarer hvordan du microinject en kombinert DNA/lipofection-reagens til eyebuds av en dag gammel embryo slik at eksogene gener uttrykkes i ett eller et lite antall optiske neurons. Ved å tagge gener med GFP eller co-sprøyte med en GFP plasmider, Terminal axonal arbors av individuelle optiske neurons med endrede molekylære signalering kan bli avbildet direkte i hjernen av intakt, levende Xenopus rumpetroll flere dager senere, og deres morfologi kan være kvantifisert. Denne protokollen gir mulighet for bestemmelse av celle-autonome molekylære mekanismer som ligger til grunn utviklingen av optiske axon arborization in vivo.
Introduction
Under utviklingen av nervesystemet, axons av presynaptiske nerve neurons navigere gjennom ulike regioner av hjernen for å nå sine målområder. Når axons invadere deres mål vev, etablerer de Synaptic forbindelser med postsynaptic mål neurons. I mange typer neurons, axons øke antallet og romlige omfanget av Synaptic forbindelser de kan gjøre ved utarbeide nettverk av Terminal grener eller arbors1. Den retino-tectal projeksjon av rumpetroll av akvatiske frosken Xenopus laevis er en kraftig virveldyr modell for å undersøke mekanismer underliggende Terminal axon arborization og Synaptic connectivity2,3,4 . Individuell GFP uttrykke optikk axonal arbors med normal og endret molekylær signalering kan observeres direkte i intakt, Living Xenopus rumpetroll5,6,7,8. For å uttrykke GFP alene eller sammen med full lengde eller avkortet versjoner av gener i små antall optiske neurons, bruker vi en teknikk som involverer microinjection/lipofection av DNA i eyebuds av en dag gammel Xenopus embryo9, 10. denne teknikken ble opprinnelig utviklet for å studere mekanismer for optikk axon pathfinding i unge Xenopus rumpetroll, og har siden blitt brukt av oss og andre til å bestemme celle-autonome molekylære mekanismer underliggende optikk axon arborization i Xenopus rumpetroll5,6,7,8,9,10.
Alternative teknikker for å uttrykke eksogene gener i et lite antall optiske neurons har blitt utviklet i andre modell arter, så vel som i X. laevis. Men hver av disse tilnærmingene presenterer utfordringer og begrensninger i forhold til microinjection av DNA/lipofection reagens i eyebuds av Xenopus embryo. Hos mus kan transgenesis brukes til å uttrykke gener i et lite antall optiske neurons, men generering av transgene mus er kostbart og tidkrevende og transgene mus ofte til stede med uønskede bivirkninger11. Transgene sebrafisk som uttrykker eksogene gener i optiske neurons kan også skapes ved å injisere plasmider i tidlige kløft scenen embryo12. Imidlertid krever denne prosessen kloning av en bestemt promoter å uttrykke gener i en mosaikk mønster i optiske neurons i sebrafisk larver12. Hyppigheten av uttrykk for eksogene DNA i optiske neurons i transgene sebrafisk er også noe lavere (< 30%) sammenlignet med Xenopus rumpetroll som ble MICROINJECTED med DNA/liposomal-reagens (30 − 60%)12. I ovo electroporation har også blitt brukt til å uttrykke gener i et lite antall optiske neurons i kyllinger13. Imidlertid har denne prosedyren ikke fullt ut karakterisere mekanismer som etablerer optisk anslag fordi optikk axon arborization ikke kan bli avbildet i intakt, levende Chick embryo. Endelig har flere laboratorier brukt electroporation til å transfect gener i små antall optiske neurons i Xenopus rumpetroll14,15. Likevel krever electroporation optimalisering av utstyr og protokoller (stimulator, elektroder, romlige og timelige mønstre av bølge pulser) utover det som brukes for microinjection av DNA/lipofection reagens i eyebuds av Xenopus embryo.
Vi og andre tidligere brukt teknikken av microinjection/lipofection av DNA i eyebuds av Xenopus embryo å bestemme celle autonome signalering mekanismer som etablerer optikk axon arborization5,6, 7 andre er , 8. vi i utgangspunktet brukt denne tilnærmingen til å analysere funksjonene til Cadherin og wnt adapter protein β-catenin i optikk axonal arborization i Xenopus rumpetroll5,6. I en studie viste vi at β-catenin binding til α-catenin og til PDZ kreves, henholdsvis for initiering og forme optikk axonal arbors in vivo5. I en annen rapport, viste vi at β-catenin bindende domener for α-catenin og GSK-3β oppositely modulere projeksjon mønstre av ventrale optikk axonal arbors6. Flere nylig identifiserte vi roller for wnt faktor, adenomatøse poliposis coli (APC), i regulering morfologiske funksjoner av optikk axonal arbors i Xenopus rumpetroll7. Av co-uttrykker N-terminalen og sentrale domener av APC som modulere β-catenin stabilitet og mikrotubulinettverket organisasjon sammen med GFP i individuelle optiske neurons, vi bestemt delte og distinkte roller for disse APC interaksjon domener på grenen nummer, lengde og vinkel i optisk axonal arbors in vivo7. Et annet laboratorium brukte microinjection/lipofection teknikk for å bestemme celle autonome roller for signalering av BDNF reseptor, TrkB, i optikk axonal arbors i Xenopus rumpetroll8. Denne gruppen viste at uttrykk for en dominerende-negativ TrkB perturbed forgrening og Synaptic modning i individuelle optikk axon arbors in vivo8. Samlet har lipofection teknikken i Xenopus allerede opplyst de spesifikke rollene til ulike gener i optikk axon forgrening i det opprinnelige miljøet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen viser vi hvordan du uttrykker eksogene DNA konstruksjoner i enkelt eller lite antall optiske neurons og hvordan å avbilde individuelle GFP uttrykke optikk axonal arbors med normal og forandret molekylær signalering i intakt, levende rumpetroll av frosken X . laevis. Vi forklarer også hvordan å rekonstruere og kvantifisere morfologi av GFP uttrykke optikk axonal arbors fra bilder tatt i vivo. For å uttrykke eksogene DNA plasmider i små antall optiske neurons, microinject vi en DNA/lipofec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Touro University California College of Osteopathic Medicine for å støtte vår forskning. Vi erkjenner tidligere studenter i laboratoriet (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John lim) som bidro til å implementere denne microinjection teknikken i laboratoriet vårt. Vi er takknemlige for Dr. Christine Holt, i hvis laboratorium dette DNA microinjection/lipofection teknikk i Xenopus embryo ble først utviklet.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
