Mikroinjektion av DNA i Ögonknoppar i Xenopus laevis embryon och avbildning av GFP uttrycker optiska Axonala arbors i intakt, levande Xenopus grodyngel
Summary
Detta protokoll syftar till att visa hur man microinjicera en DNA/DOTAP blandningen i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus laevis embryon, och hur man avbildar och rekonstruera enskilda grön fluorescerande protein (GFP) uttrycker optiska axonala arbors i tectal midbrains av intakt, levande Xenopus grodyngel.
Abstract
Den primära visuella projektionen av grodyngel av vatten groda Xenopus laevis fungerar som ett utmärkt modellsystem för att studera mekanismer som reglerar utvecklingen av neuronala konnektivitet. Under etableringen av retino-tectal projektion, optiska axoner sträcker sig från ögat och navigera genom olika regioner i hjärnan för att nå sin målvävnad, den optiska tectum. När optiska axoner in i tectum, de utarbeta Terminal arbors som fungerar för att öka antalet synaptiska anslutningar de kan göra med mål interneuroner i tectum. Här beskriver vi en metod för att uttrycka DNA-kodning grönt fluorescerande protein (GFP), och vinst-och förlust av funktion gen konstruktioner, i optiska nervceller (retinala ganglionceller) i Xenopus embryon. Vi förklarar hur man microinjicera en kombinerad DNA/lipofektion reagens i ögonknoppar av en dag gamla embryon så att exogena gener uttrycks i enstaka eller ett litet antal optiska nervceller. Genom att tagga gener med GFP eller co-injicera med en GFP plasmid, Terminal axonal arbors av enskilda optiska neuroner med förändrad molekylär signalering kan avbildas direkt i hjärnan av intakt, levande Xenopus grodyngel flera dagar senare, och deras morfologi kan kvantifieras. Detta protokoll möjliggör bestämning av cell-autonoma molekylära mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av optisk Axon arborization in vivo.
Introduction
Under utvecklingen av nervsystemet, axoner av presynaptiska neuroner navigera genom olika regioner i hjärnan för att nå sina mål områden. När axoner invadera deras målvävnader, de upprättar synaptiska anslutningar med postsynaptiska mål nervceller. I många typer av nervceller, axoner öka antalet och rumsliga omfattningen av synaptiska anslutningar de kan göra genom att utarbeta nätverk av terminalen grenar eller arbors1. Den retino-tectal projektion av grodyngel av vatten groda Xenopus laevis är en kraftfull ryggradsdjur modell för att undersöka mekanismerna bakom Terminal Axon arborization och synaptisk anslutning2,3,4 . Individuell GFP uttrycker optiska axonala arbors med normal och förändrad molekylär signalering kan observeras direkt i intakt, levande Xenopus grodyngel5,6,7,8. För att uttrycka GFP ensam eller tillsammans med fullängds eller trunkerade versioner av gener i litet antal optiska neuroner, använder vi en teknik som involverar mikroinjektion/lipofektion av DNA i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus embryon9, 10. denna teknik utvecklades ursprungligen för att studera mekanismer för optisk Axon pathfinding hos unga Xenopus grodyngel, och har sedan dess tillämpats av oss och andra för att bestämma cell-autonoma molekylära mekanismer bakom optisk Axon arborization i Xenopus grodyngel5,6,7,8,9,10.
Alternativa tekniker för att uttrycka exogena gener i ett litet antal optiska nervceller har utvecklats i andra modell arter, liksom i X. laevis. Emellertid, var och en av dessa metoder presenterar utmaningar och begränsningar jämfört med görs av DNA/lipofection reagens i ögonknoppar av Xenopus embryon. Hos möss, transgenes kan användas för att uttrycka gener i ett litet antal optiska nervceller, men generationen av transgena möss är kostsamt och tidskrävande och transgena möss ofta närvarande med oönskade biverkningar11. Transgena zebrafiskar som uttrycker exogena gener i optiska nervceller kan också skapas genom injicering av plasmider i de tidiga embryona till embryon12. Denna process kräver dock kloning av en specifik promotor för att uttrycka gener i ett mosaikmönster i optiska neuroner i zebrafiskar larver12. Frekvensen av uttryck av EXOGEN DNA i optiska neuroner i transgena zebrafiskar är också något lägre (< 30%) jämfört med Xenopus grodyngel som mikroinjicerades med DNA/liposomalt reagens (30 − 60%)12. I ovo elektroporation har också använts för att uttrycka gener i ett litet antal optiska nervceller i kycklingar13. Emellertid, detta förfarande har misslyckats med att helt karakterisera mekanismer som upprättar optiska projektioner eftersom optisk Axon arborization inte kan avbildas i intakt, levande chick embryon. Slutligen har flera laboratorier använt elektroporation för att transfect gener i ett litet antal optiska neuroner i Xenopus grodyngel14,15. Ändå kräver elektroporation optimering av utrustning och protokoll (stimulator, elektroder, rumsliga och temporala mönster av våg pulser) utöver det som används för görs av DNA/lipofection reagens i ögonknoppar av Xenopus embryon.
Vi och andra tidigare använt tekniken för mikroinjektion/lipofektion av DNA i ögonknoppar av Xenopus embryon för att bestämma cell autonoma signalering mekanismer som upprättar optisk Axon arborization5,6, 7 , 8. vi använde inledningsvis denna metod för att dissekera funktionerna hos cadherin och WNT adapter protein β-catenin i optisk axonal arborization i Xenopus grodyngel5,6. I en studie visade vi att β-cateninbindning till α-catenin och till PDZ krävs för att initiera och forma optiska axonala arbors in vivo5. I en andra rapport, vi visade att β-catenin bindnings domäner för α-catenin och GSK-3β motsatt modulera projektion mönster av ventrala optiska axonala arbors6. På senare tid har vi identifierat roller för WNT Factor, adenomatös poliposis coli (APC), för att reglera morfologiska egenskaper av optiska axonala arbors i Xenopus grodyngel7. Genom att co-uttrycka N-terminalen och centrala domäner APC som modulera β-catenin stabilitet och mikrotubuli organisation tillsammans med GFP i enskilda optiska neuroner, bestämde vi delade och distinkta roller för dessa APC interaktion domäner på filialnummer, längd och vinkel i optiska axonala arbors in vivo7. Ett annat laboratorium använde microinjection/lipofection teknik för att bestämma cell autonoma roller för signalering av BDNF-receptorn, TrkB, i optiska axonala arbors i Xenopus grodyngel8. Denna grupp visade att uttrycket av en dominerande-negativ TrkB oroad förgrening och synaptisk mognad i enskilda optiska Axon arbors in vivo8. Sammantaget har lipofection tekniken i Xenopus redan belyst de specifika rollerna av olika gener i optisk Axon förgrening i den inhemska miljön.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln visar vi hur man uttrycker exogena DNA-konstruktioner i ett eller ett litet antal optiska neuroner och hur man avbildar enskilda GFP uttrycker optiska axonala arbors med normala och förändrade molekylära signalering i intakt, levande grodyngel av grodan X . laevis. Vi förklarar också hur man rekonstruera och kvantifiera morfologin av GFP uttrycker optiska axonala arbors från bilder tagna in vivo. För att uttrycka exogena DNA-plasmider i litet antal optiska neuroner, microinjicera vi en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Touro University California College of Osteopatisk medicin för att stödja vår forskning. Vi erkänner tidigare studenter i laboratoriet (Esther Wu, Gregory peng, taegun Jin, John lim) som hjälpte till att genomföra denna görs teknik i vårt laboratorium. Vi är tacksamma för Dr Christine Holt, i vars laboratorium denna DNA microinjection/lipofection teknik i Xenopus embryon utvecklades först.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
