نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام
Summary
هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوه بخطوه لاعداد وزراعه الخنازير الانقسام أزرار القرنية. كما يظهر هذا النموذج العضوي المزروع عاده معدلات وفيات الخلايا في غضون 15 يوما ، مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية ، فانه يمثل النموذج الأول الذي يسمح للزراعة طويلة الأجل من القرنيات غير البشرية دون أضافه السامة ديكسان.
Abstract
يرتبط البحث التجريبي علي الخلايا البطانية القرنية مع العديد من الصعوبات. القرنيات المتبرعة البشرية نادره ونادرا ما تكون متاحه للتحقيقات التجريبية لأنها عاده ما تكون ضرورية لزرع. الخلايا البطانية الثقافات في كثير من الأحيان لا تترجم بشكل جيد في الحالات المجرية. نظرا للخصائص الهيكلية الحيوية لقرنيات غير البشرية ، فان تورم الورم اللحمية اثناء الزراعة يؤدي إلى فقدان الخلايا البطانية القرنية الكبيرة ، مما يجعل من الصعب القيام بالزراعة لفتره طويلة من الزمن. وتستخدم عوامل أزاله الترسبات مثل دكديكان لمواجهه هذه الاستجابة. ومع ذلك ، فانها تسبب أيضا فقدان الخلايا البطانية كبيره. ولذلك ، تم إنشاء نموذج ثقافة الجهاز السابق الجسم الذي لا يتطلب وكلاء القاع. واستخدمت عيون الخنازير من مسلخ محلي لاعداد أزرار القرنية الانقسام. بعد التراص الجزئي القرنية ، تمت أزاله الطبقات الخارجية من القرنية (ظهاره ، طبقه بومان ، وأجزاء من سدي). هذا يقلل بشكل كبير من فقدان الخلايا البطانية القرنية الناجمة عن تورم الورم الدموي الضخم وطي غشاء Descemet في جميع انحاء فترات زراعه أطول ويحسن الحفاظ العام علي طبقه الخلايا البطانية. وتبع ذلك أزاله القرنية الكاملة اللاحقة من الجزء المتبقي من زر القرنية من لمبة العين والزراعة. وتم تقييم كثافة الخلايا البطانية في أوقات المتابعة التي تصل إلى 15 يوما بعد الاعداد (اي الأيام 1 و 8 و 15) باستخدام المجهر الضوئي. تقنيه التحضير المستخدمة تسمح بحفظ أفضل لطبقه الخلايا البطانية التي يتم تمكينها من خلال تورم الانسجه الأقل تضخما ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الانحدار البطيء والخطي في انقسام أزرار القرنية مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية. وبما ان هذا النموذج الموحد للبحوث الذي يزرع عاده للمرة الاولي يسمح بزراعه مستقره لمده أسبوعين علي الأقل ، فهو بديل قيم لقرنيات المتبرعين البشريين بالنسبة للتحقيقات المستقبلية للعوامل الخارجية المختلفة فيما يتعلق الآثار علي بطانة القرنية.
Introduction
إجراءات زراعه القرنية هي من بين المزارع الأكثر شيوعا في جميع انحاء العالم1. كما ان هناك نقص حاد في القرنيات المتبرعين البشرية ، والبحوث التجريبية التي تعالج الخلايا البطانية القرنية في القرنيات البشرية من الصعب أداء1. ومع ذلك ، فان إدخال حلول الري وغيرها من المواد المستخدمة داخل العين ، والاجهزه البصرية المطاطية ، فضلا عن الاداات والتقنيات الجراحية (علي سبيل المثال ، أدوات الاستحلاب والتقنيات ، والطاقة الموجات فوق الصوتية) يتطلب تحقيقات صحيحه ومستفيضة فيما يتعلق بآثارها علي بطانة القرنية قبل الاستخدام السريري.
توجد بدائل قليله لقرنيات المتبرعين البشريين للبحوث. نماذج البحوث الحيوانية هي قيمه جدا ولكن في نفس الوقت تستهلك الموارد جدا وبشكل متزايد شكك أخلاقيا. العيب الرئيسي في ثقافات الخلايا الانبوبيه هو ترجمتها المحدودة للعين البشرية. النتائج التي تم الحصول عليها من ثقافات الخلايا يمكن ان تكون غير لائقه في ظروف الجسم الحي ، لان الخلايا قد تمر بمرحله انتقاليه البطانة الغشائية (EMT) ، مما يؤدي إلى الليفية مثل المورفولوجية الناجمة عن فقدان قطبيه الخلية والتغيرات في شكل الخلية والجينات التعبير2.
في حين ذكرت السابقة نماذج الجسم القديم زراعه فترات تصل إلى 120 h فقط ، وهي تقنيه اعداد رواية لإنشاء نموذج ثقافة القرنية الغشاء الوركي الجهاز عن طريق ذبح القرنيات الخنازير الطازجة لمده 15 يوما علي الأقل وقد أدخلت مؤخرا3 ،4،5،6. إذا تمت أزاله ظهاره القرنية وأجزاء من ستروما (حوالي 300 μm في المجموع) من القرنية قبل الزراعة ، يتم تقليل تورم سدي في انقسام أزرار القرنية مما ادي إلى فقدان اقل الخلايا البطانية وبطانية الحفاظ عليها بشكل جيد طبقه الخلية بعد ما يصل إلى 15 يوما ، في حين ان أزرار القرنية غير المنقسمة تظهر خسارة كبيره في الخلايا البطانية بسبب تورم الورم المفتول وتشكيل طيات Descemet. عاده ما تستخدم بنوك العيون عوامل التشبع بالهواء الخافض للحرارة مثل ديكدكان لتقليل تورم القرنيات قبل الزرع. ومع ذلك, وأظهرت هذه العوامل للحث علي زيادة فقدان الخلايا البطانية7,8,9.
تهدف هذه المقالة إلى تصور هذا نموذج البحوث السابقة الفيفو الموحدة في بروتوكول مفصل خطوه بخطوه من أجل تمكين المحققين في المستقبل لاجراء البحوث علي بطانة القرنية باستخدام أزرار القرنية الانقسام. ويمثل هذا النموذج طريقه مباشره لاختبار المواد والتقنيات المستخدمة داخل العين ، مثل الاجهزه البصرية المطاطية ، وحلول الري ، وطاقة الموجات فوق الصوتية ، أو غيرها من الإجراءات التي يكون فيها بطانة القرنية من الفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول طريقه لاعداد الخنازير تقسيم أزرار القرنية ، والذي يمثل موحده ومنخفضه التكلفة السابقين الجسم الغشائي القرنية النموذج ثقافة الجهاز لأغراض البحث6. وأظهرت الخنازير انقسام القرنية أزرار انخفاض كثافة الخلايا البطانية مماثله لخسائر الخلايا البطانية التي لوحظ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعم إنشاء نموذج البحث المقدم من قبل KMU-ايفنتيف (FKZ: 13GW0037F) من وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا.
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
