Een porcine Corneale endotheliale orgel cultuur model met behulp van splitsen Corneale knoppen
Summary
Hier wordt een stap-voor-stap protocol voor de bereiding en de teelt van de corneale knoppen van het varkens gesplitst. Aangezien dit organo-typisch gecultiveerde orgel cultuur model de celsterfte binnen 15 dagen weergeeft, vergelijkbaar met de menselijke donor cornea’s, vertegenwoordigt het het eerste model dat langdurige teelt van niet-humane cornea’s toestaat zonder toxische dextran toe te voegen.
Abstract
Experimenteel onderzoek naar corneale endotheliale cellen wordt geassocieerd met verschillende moeilijkheden. Menselijke donor cornea’s zijn schaars en zelden beschikbaar voor experimentele onderzoeken, omdat ze normaalgesproken nodig zijn voor transplantatie. Endotheliale celculturen vertalen vaak niet goed naar in vivo situaties. Vanwege de biostructurele kenmerken van niet-menselijke cornea’s induceert stromale zwelling tijdens de teelt substantieel verlies van corneale endotheliale cellen, waardoor het moeilijk is om de teelt voor een langere periode uit te voeren. Dezwelling agenten zoals dextran worden gebruikt om deze reactie tegen te gaan. Echter, ze veroorzaken ook aanzienlijke endotheel celverlies. Daarom is een ex vivo-orgel cultuur model vastgesteld dat geen dezwelling middelen nodig heeft. Varkens ogen van een plaatselijk slachthuis werden gebruikt om gesplitste corneale knoppen voor te bereiden. Na gedeeltelijke corneale trephination werden de buitenste lagen van het hoornvlies (epitheel, Bowman-laag, delen van de stroma) verwijderd. Dit vermindert aanzienlijk het corneale endotheelcelverlies geïnduceerd door massale stromale zwelling en het membraan van Descemet in langere teelt periodes en verbetert het algemene behoud van de endotheliale cellaag. Daaropvolgende volledige corneale trephination werd gevolgd door het verwijderen van de gesplitste corneale knop van de resterende oogbol en de teelt. De endotheliale celdichtheid werd beoordeeld bij follow-uptijden van maximaal 15 dagen na de bereiding (d.w.z. dagen 1, 8, 15) met behulp van lichte microscopie. De bereidingstechniek zorgt voor een beter behoud van de endotheliale cellaag die wordt ingeschakeld door minder stromale weefsel zwelling, wat resulteert in langzame en lineaire afname percentages in gesplitste corneale knoppen vergelijkbaar met menselijke donor cornea’s. Aangezien dit gestandaardiseerde organo-typisch gecultiveerde onderzoeksmodel voor de eerste keer een stabiele teelt mogelijk maakt gedurende ten minste twee weken, is het een waardevol alternatief voor menselijke donor cornea’s voor toekomstig onderzoek naar verschillende externe factoren met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel.
Introduction
Corneale transplantatie procedures behoren tot de meest frequent uitgevoerde transplantaties wereldwijd1. Aangezien er een ernstig tekort is aan menselijke donor cornea’s, is experimenteel onderzoek naar het aanpakken van corneale endotheel cellen in menselijke cornea’s moeilijk uit te voeren1. De introductie van irrigatie oplossingen en andere stoffen die in het oog worden gebruikt, oftalmische viscoelastische apparaten, evenals chirurgische instrumenten en technieken (bijv. phacoemulficatie-instrumenten en-technieken, ultrasone energie) vereist geldige en uitgebreide onderzoeken met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel vóór klinisch gebruik.
Er zijn weinig alternatieven voor de menselijke donor cornea’s voor onderzoek. Dieronderzoek modellen zijn zeer waardevol, maar tegelijkertijd zeer hulpbronnen consumeren en steeds meer ethisch worden ondervraagd. Een groot nadeel van in vitro celculturen is hun beperkte vertaling naar het menselijk oog. Resultaten verkregen uit celculturen kunnen in vivo voorwaarden zijn, omdat cellen endotheliale mesenchymale overgang (EMT) kunnen ondergaan, resulterend in fibroblast-achtige morfologie veroorzaakt door het verlies van celpolariteit en veranderingen in de celvorm en het gen expressie2.
Terwijl eerdere ex vivo-modellen teelt perioden van maximaal 120 uur meldden, werd onlangs een nieuwe voorbereidings techniek voor het opzetten van een varkens corneale endotheliale orgel cultuur model door het kweken van vers varken cornea’s gedurende ten minste 15 dagen geïntroduceerd3 ,4,5,6. Als het corneale epitheel en delen van de stroma worden verwijderd (ongeveer 300 μm in totaal) van het hoornvlies vóór de teelt, zwelling van de stroma wordt verlaagd in gesplitste corneale knoppen resulterend in minder endotheel celverlies en een goed onderhouden endotheliale cellaag na maximaal 15 dagen, terwijl niet-gesplitste corneale knoppen significant endotheel celverlies vertonen als gevolg van ongelijke stromale zwelling en vorming van de plooien van Descemet. Oogbanken gebruiken meestal osmotische dezwelling agenten zoals dextran om zwelling van cornea’s te verminderen voorafgaand aan transplantatie. Echter, deze agenten werden aangetoond voor het opwekken van verhoogde endotheel celverlies7,8,9.
Dit artikel is bedoeld om dit gestandaardiseerde ex vivo onderzoeksmodel in een gedetailleerd stap-voor-stap protocol te visualiseren om toekomstige onderzoekers in staat te stellen onderzoek te doen naar het corneale endotheel met behulp van gesplitste corneale knoppen. Dit model is een eenvoudige methode om stoffen en technieken te testen die in het oog worden gebruikt, zoals oftalmische viscoelastische apparaten, irrigatie oplossingen en ultrasone energie, of andere procedures waarbij het corneale endotheel van belang is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor de bereiding van de corneale knoop knoppen van varkens, die een gestandaardiseerd en voordelig ex vivo corneale endotheliaal orgel cultuur model voor onderzoeksdoeleinden6vertegenwoordigt. Porcine Split corneale knoppen toonden een afname van de endotheliale celdichtheid vergelijkbaar met endotheliale celverliezen waargenomen bij menselijke donor cornea’s gekweekt in oogbanken over een periode van twee weken6,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De oprichting van het gepresenteerde onderzoeksmodel werd gesteund door KMU-Innovativ (FKZ: 13GW0037F) van het federale ministerie van onderwijs en onderzoek Duitsland.
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
