分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル
Summary
ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。
Abstract
角膜内皮細胞に関する実験的研究は、いくつかの困難に関連している。ヒトドナー角膜は、通常移植に必要とされるため、実験調査に利用できることはほとんどありません。内皮細胞培養は、多くの場合、生体内の状況にうまく翻訳されません。非ヒト角膜の生体構造特性により、栽培中の間の間質腫脹は実質的な角膜内皮細胞損失を引き起こし、長期間培養を行うことが困難となる。デキストランなどの膨張剤は、この応答を打ち消すために使用されます。しかし、それらはまた、著しい内皮細胞損失を引き起こす。そこで、脱膨張剤を必要としない元生体臓器培養モデルが確立された。地元の屠殺場からの豚の目は、分割角膜ボタンを準備するために使用されました。部分的な角膜トレフィン化の後、角膜の外層(上皮、ボウマン層、間質の一部)を除去した。これは、大規模な間質腫脹およびデセメットの膜折りたたみによって誘発される角膜内皮細胞損失を大幅に減少させ、より長い栽培期間を通して、内皮細胞層の一般的な保存を改善する。その後、完全な角膜トレフィン化に続いて、残りの眼球および栽培から分割角膜ボタンを除去した。内皮細胞密度は、軽微小顕微鏡を用いて調製後最大15日目(すなわち、1日目、8日目、15日目)のフォローアップ時間で評価した。使用される調製技術は、より少ない間質組織の腫脹によって可能な内皮細胞層のよりよい保存を可能にし、ヒトドナー角膜に匹敵する分割角膜ボタンのゆっくりと線形減少率をもたらす。この標準化された有機栽培研究モデルは、少なくとも2週間安定した栽培を可能にするため、今後の様々な外的要因の調査に代わる貴重な代替手段である。角膜内皮への影響。
Introduction
角膜移植手順は、世界で最も一般的に行われる移植1の一つです。ヒトドナー角膜の深刻な不足があるので、ヒト角膜内皮細胞に対処する実験的研究は、ヒト角膜の1を行うことが困難である。しかし、眼内で使用される灌漑液および他の物質の導入、眼科粘弾性装置、ならびに手術器具および技術(例えば、ファコエマル化物化器具および技術、超音波エネルギー)が必要である。臨床使用前の角膜内皮への影響に関する有効かつ広範な調査。
ヒトドナー角膜に代わるものはほとんどない。動物研究モデルは非常に貴重ですが、同時に非常に資源を消費し、ますます倫理的に疑問を持っています。インビトロ細胞培養の主な欠点は、人間の目への限られた翻訳です。細胞培養から得られた結果は、細胞が内皮間葉転移(EMT)を受ける可能性があるため、細胞の極性の喪失および細胞形状および遺伝子の変化によって引き起こされる線維芽細胞様形態を引き起こす可能性があるため、生体内条件に不一致である可能性がある。式2.
以前のex vivoモデルはわずか120時間の栽培期間を報告したのに対し、少なくとも15日間新鮮な豚角膜を培養することによりブタ角膜内皮器官培養モデルを確立する新しい調製技術が最近導入された3 ,4,5,6.角膜上皮と間質の一部を栽培前に角膜から取り除くと(合計で約300μm)、間質の腫れが分断角膜ボタンで減少し、内皮細胞の損失が少なくなり、内皮が維持される最大15日後の細胞層は、非分割角膜ボタンは、不均一な間質腫脹およびデスセメットの折り目の形成による著しい内皮細胞喪失を示す。アイバンクは通常、移植前に角膜の腫脹を減らすために、デキストランなどの浸透性膨潤剤を使用する。しかしながら、これらの薬剤は、内皮細胞損失7、8、9の増加を誘導することが示された。
この論文は、将来の研究者が分割角膜ボタンを使用して角膜内皮の研究を行うことを可能にするために、この標準化されたex vivo研究モデルを詳細なステップバイステッププロトコルで可視化することを目的としています。このモデルは、眼科粘弾性デバイス、灌漑溶液、超音波エネルギー、または角膜内皮が関心のある他の手順など、眼内で使用される物質および技術をテストする簡単な方法を表す。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、研究目的6のための標準化され、低コストのexvivo角膜内皮器官培養モデルを表すブタ分割角膜ボタンの調製のための方法を提供する。ブタ分割角膜ボタンは、2週間にわたって眼科で培養されたヒトドナー角膜で観察された内皮細胞損失に匹敵する内皮細胞密度の低下を示した6,10,11,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
発表された研究モデルの確立は、ドイツ連邦教育省のKMU-innovativ(FKZ:13GW0037F)によって支援されました。
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
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