Свиная Корнел Эндотелиальная модель органной культуры с использованием сплит-корневых кнопок

Summary

Здесь представлен пошаговой протокол для приготовления и выращивания свиных роговицы. Поскольку эта органо-типично культивируемая модель культуры органов показывает показатели смертности клеток в течение 15 дней, сопоставимые с роговицами донора человека, она представляет собой первую модель, позволяющую долгосрочное культивирование нечеловеческих роговиц без добавления токсичных декрен.

Abstract

Экспериментальные исследования эндотелиальных клеток роговицы связаны с несколькими трудностями. Роговицы донора человека являются скудными и редко доступны для экспериментальных исследований, поскольку они обычно необходимы для трансплантации. Эндотелиальные клеточные культуры часто не очень хорошо переводятся в ситуации in vivo. Из-за биоструктурных характеристик нечеловеческих роговиц, стромальный отек во время выращивания вызывает значительную потерю эндотелиальных клеток роговицы, что затрудняет культивирование в течение длительного периода времени. Для противодействия этому ответу используются деозавуированные агенты, такие как декек. Тем не менее, они также вызывают значительную потерю эндотелиальных клеток. Таким образом, была создана модель культуры культуры ex vivo, не требующая деотечных агентов. Свиньи глаза из местной скотобойни были использованы для подготовки раскол роговицы кнопки. После частичного трефинации роговицы внешние слои роговицы (эпителий, слой лукмана, части стромы) были удалены. Это значительно снижает потери эндотелиальных клеток роговицы, вызванные массивным стромальным отеком и мембраной Десцемета, складывающейся в течение более длительных периодов культивирования, и улучшает общее сохранение эндотелиального клеточного слоя. Последующее полное трифинирование роговицы последовало удаление раскол апогея кнопки из оставшейся луковицы глаза и выращивания. Плотность эндотелиальных клеток оценивалась в период ы наблюдения до 15 дней после приготовления (т.е. дней 1, 8, 15) с помощью световой микроскопии. Используемый метод подготовки позволяет лучше сохранить эндотелиальный слой клеток, включенный менее стромальным отеком тканей, что приводит к медленному и линейному снижению в сплит-кнопках роговицы, сопоставимых с роговицами донора человека. Поскольку эта стандартизированная органо-типично культивируемая исследовательская модель впервые позволяет стабильно культивироваться в течение по крайней мере двух недель, она является ценной альтернативой кукурузе донора человека для будущих исследований различных внешних факторов в отношении их оказывает влияние на эндотелий роговицы.

Introduction

Процедуры трансплантации корневой трансплантации являются одними из наиболее часто выполняемых трансплантаций во всем мире¹. Как существует острая нехватка человеческих доноров роговицы, экспериментальные исследования решения роговицы эндотелиальных клеток в роговицы человека трудно выполнить¹. Однако внедрение оросительных растворов и других веществ, используемых в глазу, офтальмологических вязкоупругих устройств, а также хирургических инструментов и методов (например, инструменты и методы факоэмульсификации, ультразвуковая энергия) требует действительные и обширные исследования относительно их воздействия на эндотелий роговицы перед клиническим использованием.

Немногие альтернативы донорской роговицы человека существуют для исследований. Модели исследований на животных очень ценны, но в то же время очень ресурсоемкие и все более под сомнение этически. Основным недостатком культур клеток in vitro является их ограниченный перевод человеческому глазу. Результаты, полученные из клеточных культур может быть несовместимы с условиями in vivo, потому что клетки могут претерпеть эндотелиальный мезенхимальный переход (EMT), в результате чего фибробластоподобная морфология вызвана потерей клеточной полярности и изменениями в форме клеток и гене выражение².

В то время как предыдущие модели ex vivo сообщили периоды выращивания до всего 120 ч, новый метод подготовки к созданию свиной роговицы эндотелиальной модели культуры органов путем культивирования свежей свиной роговицы, по крайней мере 15 дней был недавно введен^{3 ,4,5,6}. Если эпителий роговицы и части стромы удаляются (всего около 300 мкм) из роговицы до культивирования, отек стромы уменьшается в разделенных кнопках роговицы, что приводит к меньшей эндотелиальной потере клеток и ухоженной эндотелиальной клеточный слой после 15 дней, в то время как не расщепленные кнопки роговицы показывают значительную эндотелиальную потерю клеток из-за неравномерного стромального отека и образования складок Десцемета. Глаз банки обычно используют осмотические деоретные агенты, такие как декек, чтобы уменьшить отек роговицы до трансплантации. Тем не менее, эти агенты были показаны, чтобы вызвать увеличение эндотелиальной потери клеток^7,8,9.

Эта статья направлена на визуализацию этой стандартизированной модели исследования ex vivo в подробном пошаговом протоколе, чтобы позволить будущим следователям проводить исследования по эндотелию роговицы с помощью сплит-кнопок роговицы. Эта модель представляет собой простой метод для тестирования веществ и методов, используемых в глазу, таких как офтальмологические вязкоупругие устройства, оросительные растворы, и ультразвуковой энергии, или другие процедуры, где эндотелий роговицы представляет интерес.

Protocol

Этот протокол соответствует этическим принципам нашего учреждения. В соответствии с уставом комитета по этике нашего учреждения до начала экспериментов не должно было быть получено никакого этического утверждения, так как все свиные роговицы были получены с местной скотобойни. <p cla…

Representative Results

Представленный метод вскрытия подразумевает частичное удаление стромальной ткани, в результате чего более тонкий образец роговицы и, таким образом, менее стромальный отек(рисунок 1 и рисунок 2). Менее стромальный отек вызывает меньше с?…

Discussion

Этот протокол предоставляет метод для подготовки свиной сплит роговицы кнопки, которая представляет собой стандартизированные и недорогие ex vivo роговицы эндотелиальной модели культуры органов для исследовательских^{целей 6}. Свиной раскол роговицы кнопки показали снижение…

Materials

Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland