Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

Summary

Aqui, um protocolo passo a passo para a preparação e o cultivo de botões córneos rachados suínos é apresentado. Como este modelo organo-tipicamente cultivado da cultura do órgão mostra taxas de morte da pilha dentro de 15 dias, comparável às córneas doadoras humanas, representa o primeiro modelo permitindo o cultivo a longo prazo de córneas não-humanas sem adicionar o Dextran tóxico.

Abstract

A pesquisa experimental sobre as células endoteliais da córnea está associada a várias dificuldades. As córneas doadoras humanas são escassas e raramente estão disponíveis para investigações experimentais, pois são normalmente necessárias para o transplante. As culturas de células endoteliais muitas vezes não se traduzem bem em situações in vivo. Devido às características bioestruturais de córneas não humanas, o inchamento stromal durante o cultivo induz a perda endothelial córnea substancial da pilha, que faz difícil executar o cultivo por um período de tempo prolongado. Os agentes de deswelling tais como o dextrano são usados para neutralizar esta resposta. No entanto, eles também causam significativa perda de células endoteliais. Portanto, estabeleceu-se um modelo de cultura de órgãos ex vivo que não necessitava de agentes de deswelling. Os olhos do porco de um matadouro local foram usados para preparar os botões córneos rachados. Após a trephinação córnea parcial, as camadas exteriores da córnea (epitélio, camada do Bowman, partes do estroma) foram removidas. Isto reduz significativamente a perda endothelial córnea da pilha induzida pelo inchamento stromal maciço e Descemet ‘ dobra da membrana de s durante períodos mais longos do cultivo e melhora a preservação geral da camada endothelial da pilha. O trefinação córneo completo subseqüente foi seguido pela remoção da tecla córnea rachada do bulbo e do cultivo restantes do olho. A densidade de células endoteliais foi avaliada em tempos de seguimento de até 15 dias após a preparação (i.e., dias 1, 8, 15) utilizando microscopia de luz. A técnica da preparação usada permite uma melhor preservação da camada endothelial da pilha permitida pelo inchamento menos stromal do tecido, que conduz às taxas lentas e lineares do declínio nos botões córneos rachados comparáveis às córneas doadoras humanas. Como este modelo de pesquisa organo-tipicamente cultivado padronizado pela primeira vez permite um cultivo estável por pelo menos duas semanas, é uma alternativa valiosa para as córneas de doadores humanos para futuras investigações de vários fatores externos em relação à sua efeitos sobre o endotélio corneano.

Introduction

Os procedimentos de transplante de córnea estão entre os transplantações mais comumente realizados no mundo¹. Como há uma escassez severa de córneas doadoras humanas, a pesquisa experimental que aborda as células endoteliais corneanas em córneas humanas é difícil de realizar¹. No entanto, a introdução de soluções de irrigação e outras substâncias utilizadas no olho, dispositivos viscoelásticos oftalmológicos, bem como instrumentos e técnicas cirúrgicas (por exemplo, instrumentos e técnicas de facoemulsificação, energia de ultra-som) requer investigações válidas e extensivas a respeito de seus efeitos no endotélio córneo antes do uso clínico.

Poucas alternativas às córneas doadoras humanas existem para a pesquisa. Modelos de pesquisa animal são muito valiosos, mas ao mesmo tempo muito consumo de recursos e cada vez mais questionado eticamente. Uma grande desvantagem das culturas de células in vitro é a sua tradução limitada para o olho humano. Os resultados obtidos a partir de culturas celulares podem ser incongruentes em condições in vivo, pois as células podem sofrer transição mesenquimal endotelial (EMT), resultando em morfologia fibroblástica causada pela perda da polaridade celular e alterações na forma celular e no gene expressão².

Considerando que os modelos ex vivo anteriores relataram períodos de cultivo de até apenas 120 h, uma nova técnica de preparo para estabelecer um modelo de cultura de órgãos endoteliais da córnea porcina, cultivando córneas de suínos frescos por pelo menos 15 dias foi recentemente introduzida^{3 ,4,5,6}. Se o epitélio corneano e as partes do estroma forem removidos (aproximadamente 300 μm no total) da córnea antes do cultivo, o inchaço do estroma é reduzido em botões córneos divididos, resultando em menor perda de células endoteliais e um bem mantido endotelial camada da pilha após até 15 dias, visto que os botões córneos não-rachados mostram a perda endothelial significativa da pilha devido ao inchamento stromal desigual e à formação de Descemet ‘ dobras de s. Os bancos do olho usam geralmente agentes de deswelling osmótica tais como o dextrano para reduzir o inchamento das córneas antes da transplantação. Entretanto, esses agentes demonstraram induzir aumento da perda^decélulas endoteliais^7,8,9.

Este artigo tem como objetivo Visualizar este modelo de pesquisa ex vivo padronizado em um protocolo detalhado passo a passo, a fim de permitir que futuros investigadores realizem pesquisas sobre o endotélio corneano usando botões córneos divididos. Este modelo representa um método direto para testar substâncias e técnicas utilizadas dentro do olho, tais como dispositivos viscoelásticos oftalmológicos, soluções de irrigação, e energia de ultra-som, ou outros procedimentos onde o endotélio corneano é de interesse.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes éticas de nossa instituição. De acordo com os estatutos do Comitê de revisão ética da nossa instituição, nenhuma aprovação ética teve que ser obtida antes dos experimentos, pois todas as córneas suíno foram obtidas do matadouro local. 1. cultura de órgãos Prepare os olhos de porco. Do matadouro local, obtenha os olhos do porco que foram removidos logo pós-morte mas antes do tratamento térmico. Transportar os olhos para o lab…

Representative Results

A técnica de dissecção apresentada implica a remoção parcial do tecido estromal, resultando em uma amostra de córnea mais fina e, portanto, menos inchaço estromal (Figura 1 e Figura 2). Menos inchaço estromal induz menos cisalhamento e apertar forças que têm um impacto negativo sobre o endotélio corneano, causando menor taxa de perda de células endoteliais6. As teclas córneas rachadas mostram …

Discussion

Este protocolo fornece um método para a preparação de botões córneos rachados suínos, que represente um modelo endotélio da cultura do órgão endothelial ex vivo estandardizado e de baixo custo para finalidades da pesquisa⁶. Os botões córneos rachados porcine mostraram uma diminuição da densidade endothelial da pilha comparável às perdas endothelial da pilha observadas nas córneas doadoras humanas cultivadas em bancos do olho durante um período de duas semanas^6</s…

Materials

Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland