Vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos
Summary
Este manuscrito descreve um método de criopreservação sem gelo para grandes quantidades de hepatócitos de ratos em que as células primárias são pré-incubadas com agentes crioprotetores em baixa concentração e vitrificadas em grandes gotículas.
Abstract
A vitrificação é uma alternativa promissora sem gelo para a criopreservação clássica de congelamento lento (a aproximadamente 1 °C/min) de amostras biológicas. A vitrificação requer taxas de resfriamento extremamente rápidas para alcançar a transição da água para a fase de vidro, evitando a formação de gelo prejudicial. Embora a pré-incubação com agentes crioprotetores (CPA) possa reduzir a taxa crítica de resfriamento de amostras biológicas, altas concentrações são geralmente necessárias para permitir a criopreservação sem gelo por vitrificação. Como resultado, a vitrificação é dificultada pela toxicidade do CPA e restrita a pequenas amostras que podem ser resfriadas rapidamente. Demonstrou-se recentemente que estas limitações inerentes podem ser superadas pela vitrificação da gota maioria. Usando este método novo, as pilhas são pre-incubadas primeiramente com uma baixa concentração intracelular do CPA. Aproveitando a desidratação osmótica rápida, o CPA intracelular está concentrado diretamente à frente da vitrificação, sem a necessidade de equilibrar totalmente as concentrações tóxicas de CPA. A desidratação celular é realizada em um dispositivo fluídico e integrada com a geração contínua de alta taxa de produção de gotículas de grande porte que são vitrificadas em nitrogênio líquido. Este método de criopreservação sem gelo com toxicidade mínima de CPA é adequado para grandes quantidades celulares e resulta em maior viabilidade hepatocito e função metabólica em comparação com a criopreservação clássica de congelamento lento. Este manuscrito descreve os métodos para vitrificação bem-sucedida de gotículas em massa em detalhes.
Introduction
Perda de viabilidade celular e função metabólica após criopreservação de hepatócitos ainda é uma questão importante que limita as aplicações clínicas1,2,3. O método de referência da criopreservação de hepatocitos é o congelamento lento, que é realizado por pré-incubação dos hepatócitos com CPA (dimetil sulfoxida [DMSO], glicose e albumina) e subsequente congelamento da taxa controlada (em aproximadamente 1 °C/min) para temperaturas criogênicas4,5. Apesar de muitas otimizações relatadas, a toxicidade do CPA, juntamente com desequilíbrios osmóticos injuriosos durante o congelamento e o estresse mecânico da formação de gelo, continuam a ser inconvenientes fundamentais de congelamento lento6,7.
Vitrificação oferece uma vantagem sobre o congelamento lento em que a lesão devido à formação de gelo é completamente evitado por uma transição de fase direta da água para o estado de vidro6. No entanto, para atingir a temperatura de transição de vidro da água pura (-137 °C), a água deve ser resfriada a taxas na ordem de um milhão de graus Celsius por segundo (ou seja, a taxa crítica de resfriamento) para evitar a formação de gelo acima da temperatura de transição de vidro8 . A adição de CPAs pode abaixar a taxa refrigerando crítica e aumentar a temperatura de transição de vidro de soluções aquosas9. No entanto, mesmo com altas concentrações de CPA (por exemplo, 40% v/v DMSO ou maiores) taxas de resfriamento rápido são necessárias para vitrificação bem-sucedida8,9.
As taxas de resfriamento necessárias e altas concentrações de CPA resultam em duas grandes desvantagens da vitrificação. Primeiro, para permitir o resfriamento rápido, as amostras devem ter uma baixa massa térmica. Em segundo lugar, para atingir altas concentrações de CPA, evitando lesões osmóticas, os CPAs devem ser lentamente introduzidos e totalmente equilibrados entre os compartimentos intra e extracelular6. Isso aumenta o tempo de exposição das células para CPAs tóxicos. Juntos, isso torna a vitrificação um processo complicado que se limita a algumas amostras de pequeno porte (microlitros) de cada vez. A vitrificação de gotículas foi proposta como uma solução potencial para essas restrições. Ao expor gotículas minúsculas carregadas de células (nanolitros) a nitrogênio líquido, a taxa de resfriamento é significativamente aumentada, o que, consequentemente, permite uma redução considerável na concentração de CPA10,11,12 13,14. Embora vários bicos geradores de gotículas de alta frequência possam ser usados simultaneamente, o tamanho das gotículas extremamente pequenalimita a taxa de produção a microlitros por minuto10,o que impede a vitrificação eficiente de grandes células volumes com magnitudes maiores taxas de processamento na ordem de mililitros por minuto.
Recentemente, foi demonstrado que essas limitações inerentes à vitrificação podem ser superadas pela vitrificação de gotículas em massa15. Este novo método aproveita a desidratação osmótica rápida para concentrar uma concentração intracelular de CPA de 7,5% v/v etilenoglicol e DMSO imediatamente precedendo a vitrificação, eliminando a necessidade de equilíbrio total das concentrações tóxicas de CPA. A desidratação celular é realizada em um dispositivo fluídico por uma breve exposição dos hepatócitos a uma alta concentração extracelular de CPA. Embora esta exposição cause a desidratação osmótica rápida, é demasiado curta para que a concentração elevada do CPA difunda nas pilhas. Imediatamente após a desidratação, as células são carregadas em gotículas que são diretamente vitrificadas em nitrogênio líquido. Este método elimina a necessidade de captação intracelular completa de altas concentrações de CPA, enquanto a alta concentração de CPA extracelular permite a vitrificação de gotículas de grande porte, resultando em altos volumes de taxa de rendimento com toxicidade mínima de CPA.
A vitrificação de gotículas melhora a viabilidade direta e de longo prazo após a preservação, bem como a morfologia e a função metabólica dos hepatócitos primários de ratos em comparação com a criopreservação clássica por15de congelamento lento. Este manuscrito fornece os detalhes metodológicos para vitrificação de gotículas em massa de hepatócitos primários de ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Criopreservação de hepatócitos por congelamento lento resulta em redução da viabilidade e função metabólica. Vitrificação oferece uma alternativa promissora para a criopreservação clássica, como lesão de congelamento é completamente evitado9. No entanto, a pré-incubação com CPAs é necessária para reduzir a taxa de resfriamento crítico8. Consequentemente, a vitrificação é dificultada pela toxicidadecpa 17 e limitada a pequenos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01DK096075, R01DK107875 e R01DK114506) e do Departamento de Defesa dos EUA (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) é muito reconhecido.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
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