Массовая витрификация капель для первичного сохранения гепатоцитов
Summary
Данная рукопись описывает метод криоконсервации для больших количеств крысиных гепатоцитов, при котором первичные клетки предварительно инкубируются криопротекторными агентами при низкой концентрации и отрифицируются в крупных каплях.
Abstract
Витрификация является перспективной безледной альтернативой классической медленной заморозке (приблизительно при температуре 1 кв/мин) криоконсервации биологических образцов. Витрификация требует чрезвычайно быстрых скоростей охлаждения для достижения перехода воды в стеклянную фазу, избегая при этом вредного образования льда. Хотя прединкубация криопротекторными средствами (CPA) может снизить критическую скорость охлаждения биологических образцов, высокие концентрации, как правило, необходимы для обеспечения свободного ото льда криоконсервации путем витрификации. В результате, витрификация затрудняется токсичностью CPA и ограничивается небольшими образцами, которые могут быть охлаждены быстро. Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения могут быть преодолены путем витрификации капель. Используя этот новый метод, клетки сначала предварительно инкубируются с низкой внутриклеточной концентрацией CPA. Используя быстрое осмотическое осмотическое обезвоживание, внутриклеточная CPA концентрируется непосредственно перед витрификации, без необходимости полностью уравновесить токсичные концентрации CPA. Обезвоживание клеток осуществляется в жидком устройстве и интегрируется с непрерывным высоким генерикцией больших размеров капель, которые витрифицированы в жидком азоте. Этот метод криоконсервации без оледочного льда с минимальной токсичностью CPA подходит для больших количеств клеток и приводит к повышению жизнеспособности гепатоцитов и метаболической функции по сравнению с классической медленной замораживанием криоконсервации. В данной рукописи подробно описаны методы успешного витрификации капель.
Introduction
Потеря жизнеспособности клеток и метаболической функции после криоконсервации гепатоцитов по-прежнему является серьезной проблемой, которая ограничивает клинические применения1,2,3. Эталонным методом криоконсервации гепатоцитов является медленное замораживание, которое осуществляется путем предварительного инкубации гепатоцитов cpA (диметилсульфид (DMSO), глюкозы и альбумина) и последующего контролируемого замораживания скорости (приблизительно при температуре 1 кВ/мин) до криогенные температуры4,5. Несмотря на многие сообщения об оптимизации, токсичность CPA вместе с вредными осмотическими дисбалансами во время замораживания и механическим напряжением образования льда остаются фундаментальными недостатками медленного замораживания6,7.
Vitrification предлагает преимущество над медленным замораживанием в том ушибе из-за образования льда вполне во избежание сразу переходом участка воды в положение стекла6. Однако, чтобы достичь температуры перехода стекла чистой воды (-137 градусов по Цельсию), вода должна охлаждаться со скоростью порядка одного миллиона градусов по Цельсию в секунду (т.е. критическая скорость охлаждения), чтобы избежать образования льда над температурой перехода стекла8 . Добавление CPA может снизить критическую скорость охлаждения и увеличить температуру перехода стекла aqueous решений9. Однако, даже при высокой концентрации CPA (например, 40% v/v DMSO или выше) быстрые скорости охлаждения, тем не менее, необходимы для успешного витрификации8,9.
Требуемые темпы охлаждения и высокая концентрация CPA приводят к двум основным недостаткам витрификации. Во-первых, для обеспечения быстрого охлаждения образцы должны иметь низкую тепловую массу. Во-вторых, для достижения высоких концентраций CPA, избегая при этом осмотических травм, CPAs должны быть медленно введены и полностью уравновешивать между внутри- и внеклеточными отсеками6. Это увеличивает время воздействия клеток на токсичные CPAs. Вместе это делает витрификацию громоздким процессом, который ограничивается несколькими небольшими образцами (микролитрами) за один раз. Витрификация droplet была предложена в качестве потенциального решения этих ограничений. Путем подвергать подвергать действию миниатюрные клетк-нагруженные капли (нанолитры) к жидкому азоту скорость охлаждения значительно увеличена, которая следовательно позволяет значительно уменьшение в концентрации CPA10,11,12 ,13,14. Хотя несколько высокочастотных капель генерирующих сопла потенциально могут быть использованы одновременно, очень небольшой размер капли ограничивает пропускную мощность до микролитров в минуту10, что исключает эффективное стеклоизацию больших клеток объемы с величинами более высокие темпы обработки на порядок миллилитров в минуту.
Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения витрификации могут быть преодолены с помощью объемной витрификации капель15. Этот новый метод использует быстрое осмотическое обезвоживание, чтобы сконцентрировать внутриклеточную концентрацию CPA 7,5% v/v этиленгликоль и DMSO непосредственно предшествующие витрификации, устраняя необходимость полного равновесия токсичных концентраций CPA. Клеточное обезвоживание осуществляется в жидком устройстве путем краткого воздействия гепатоцитов на высокую внеклеточное концентрацию CPA. Хотя это воздействие вызывает быстрое осмотическое обезвоживание, это слишком короткий для высокой концентрации CPA, чтобы диффундировать в клетки. Сразу после обезвоживания клетки загружаются в капли, которые непосредственно витрифицированы в жидком азоте. Этот метод устраняет необходимость полного внутриклеточного поглощения высоких концентраций CPA, в то время как высокая внеклеточное концентрация CPA позволяет витрификации крупных размеров капель, в результате чего высокие объемы пропускной способностью с минимальной токсичностью CPA.
Капля витрификация улучшает прямую и долгосрочную жизнеспособность после сохранения, а также морфологию и метаболическую функцию первичных крысиных гепатоцитов по сравнению с классической криоконсервацией путем медленного замораживания15. Данная рукопись содержит методологические детали для оплошной витрификации первичных крысиных гепатоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Криоконсервация гепатоцитов путем медленного замораживания приводит к снижению жизнеспособности и метаболической функции. Витрификация предлагает перспективную альтернативу классической криоконсервации, так как замораживания травмы полностью избежать9. Тем не менее, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения США (R01DK096075, R01DK107875 и R01DK114506) и Министерства обороны США (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) является весьма признанным.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
