Primer Hepatosit Korunması için Dökme Damlacık Vitrifikasyon
Summary
Bu el yazması, büyük miktarlarda sıçan hepatositleri için buzsuz kriyopreservation yöntemini açıklar ve böylece birincil hücreler düşük konsantrasyonda kriyoprotektif ajanlarla önceden kuluçkaya yatırılır ve büyük damlacıklarda vitrifiye edilir.
Abstract
Vitrifikasyon, biyolojik numunelerin klasik yavaş donma (yaklaşık 1 °C/dk) kriyopreservation için umut verici bir buzsuz alternatiftir. Vitrifikasyon, zararlı buz oluşumunu önlerken suyun cam faza geçişini sağlamak için son derece hızlı soğutma hızları gerektirir. Kriyoprotektif ajanlar (CPA) ile pre-inkübasyon biyolojik numunelerin kritik soğutma hızını azaltabilir rağmen, yüksek konsantrasyonlarda genellikle vitrifikasyon ile buzsuz kriyopreservation sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon EBM toksisitesi tarafından engellenir ve hızlı soğutulabilen küçük numuneler ile sınırlıdır. Son zamanlarda bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem kullanılarak, hücreler ilk olarak düşük hücre içi EBM konsantrasyonu ile ön kuluçkaya yatırılır. Hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanan hücre içi EBM, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengelemeye gerek kalmadan vitrifikasyonun hemen öncesinde yoğunlaşmıştır. Hücresel dehidratasyon akışkan bir cihazda gerçekleştirilir ve sıvı nitrojen vitrifiye büyük boyutlu damlacıkların sürekli yüksek iş üretimi ile entegre. Minimum EBM toksisitesi ile bu buzsuz kriyopreservation yöntemi büyük hücre miktarları için uygundur ve klasik yavaş dondurucu kriyopreservation ile karşılaştırıldığında artmış hepatosit canlılık ve metabolik fonksiyon sonuçları. Bu el yazması, başarılı toplu damlacık vitrifikasyon yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Introduction
Hepatositkriyat kriyopreservation sonra hücre canlılığı ve metabolik fonksiyon kaybı hala klinik uygulamaları sınırlayan önemli bir konudur1,2,3. Hepatosit kriyopatinin kriter yöntemi, hepatositlerin EBM (dimetil sülfoksit [DMSO], glikoz ve albumin) ile önceden kuluçkaya yatırılarak ve daha sonra kontrollü oranda dondurularak (yaklaşık 1 °C/dk) yavaş donma yöntemidir. kriyojenik sıcaklıklar4,5. Birçok bildirilen optimizasyonlar rağmen, Buz oluşumunun donma ve mekanik stres sırasında zararlı ozmotik dengesizlikler ile birlikte EBM toksisitesi yavaş donma temel sakıncaları kalır6,7.
Vitrifikasyon, buz oluşumu nedeniyle oluşan bu yaralanmada yavaş donma üzerinde bir avantaj sağlar tamamen cam durumuna su doğrudan faz geçiş ile kaçınılır6. Ancak, saf suyun cam geçiş sıcaklığına (-137 °C) ulaşmak için, su cam geçiş sıcaklığının üzerinde buz oluşumunu önlemek için saniyede bir milyon santigrat derece (yani kritik soğutma hızı) sırasına göre soğutulmalıdır8 . EBM’lerin eklenmesi kritik soğutma hızını düşürebilir ve sulu çözeltilerin cam geçiş sıcaklığını artırabilir9. Ancak, yüksek EBM konsantrasyonları ile bile (örneğin, 40% v / v DMSO veya daha yüksek) hızlı soğutma oranları yine de başarılı vitrifikasyon için gereklidir8,9.
Gerekli soğutma hızları ve yüksek EBM konsantrasyonları vitrifikasyon un iki büyük dezavantajına neden olmaktadır. İlk olarak, hızlı soğutma sağlamak için, örnekler düşük bir termal kütleye sahip olmalıdır. İkinci olarak, ozmotik yaralanmayı önlerken yüksek EBM konsantrasyonlarına ulaşmak için, EBM’ler yavaş yavaş tanıtılmalı ve hücre içi ve hücre dışı bölmeler arasında tam olarak dengelenmelidir6. Bu toksik EBM’lere hücrelerin maruz kalma süresini artırır. Birlikte, bu vitrifikasyon bir seferde birkaç küçük boyutlu örnekleri (mikrolitre) ile sınırlı hantal bir süreç yapar. Damlacık vitrifikasyon bu kısıtlamalar için potansiyel bir çözüm olarak önerilmiştir. Küçük hücre yüklü damlacıkları (nanolitreler) sıvı nitrojene maruz bırakarak soğutma hızı önemli ölçüde artar, bu da sonuç olarak EBM konsantrasyonunda önemli bir azalma sağlar10,11,12 ,13,14. Birden fazla yüksek frekanslı damlacık üreten nozullar potansiyel olarak aynı anda kullanılabilir olsa da, son derece küçük damlacık boyutu dakikada mikrolitre10için üretim sınırlar , hangi büyük hücre verimli vitrifikasyon engelleyen dakikada mililitre sırasına göre büyüklükleri daha yüksek işleme oranları ile hacimleri.
Son zamanlarda vitrifikasyon bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon15ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem, tüp bebekleşmeden hemen önce %7,5 v/v etilen glikol ve DMSO hücre içi CpA konsantrasyonunu yoğunlaştırmak için hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanarak toksik EBM konsantrasyonlarının tam dengelenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücresel dehidratasyon, hepatositlerin yüksek hücre dışı CpA konsantrasyonuna kısa bir maruziyeti ile akışkan bir cihazda gerçekleştirilir. Bu maruz kalma hızlı ozmotik dehidratasyonneden olsa da, hücrelere yaymak için yüksek EBM konsantrasyonu için çok kısa. Dehidratasyondan hemen sonra hücreler sıvı nitrojenle doğrudan vitrifiye edilen damlacıklarla yüklenir. Bu yöntem yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonlarının tam hücre içi alım ihtiyacını ortadan kaldırırken, yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonu büyük boyutlu damlacıkların vitrifikasyonunu sağlar ve bu da minimum EBM toksisitesi ile yüksek üretim hacimleri sağlar.
Damlacık vitrifikasyon koruma dan sonra doğrudan ve uzun vadeli canlılık artırır, yanı sıra yavaş donma tarafından klasik kriyopreservation göre birincil sıçan hepatositlerin morfolojisi ve metabolik fonksiyonu15. Bu el yazması, birincil sıçan hepatositlerinin toplu damlacık vitrifikasyonu için metodolojik ayrıntıları sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatositlerin yavaş donma sonucu ile kriyopreservation azaltılmış canlılık ve metabolik fonksiyon. Vitrifikasyon klasik kriyopreservation için umut verici bir alternatif sunuyor, dondurucu yaralanma tamamen kaçınılır gibi9. Ancak, kritik soğutma oranını düşürmekiçin EBM’ler ile kuluçka öncesi 8 gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon CpA toksisitesi17 tarafından engellenir ve küçük numune hacimleri ile sınırlıdır. Bu sı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK096075, R01DK107875 ve R01DK114506) ve ABD Savunma Bakanlığı’ndan (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) gelen finansman büyük ölçüde kabul edilmektedir.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
