Summary
Vi presenterar en flödescytometri metod för att identifiera samtidigt olika celltyper hämtas från mushjärna eller ryggmärg. Denna metod skulle kunna utnyttjas för att isolera eller karakterisera rena cellpopulationer i neurodegenerativa sjukdomar eller för att kvantifiera omfattningen av cell inriktningen vid in vivo-administrering av virala vektorer eller nanopartiklar.
Abstract
De senaste framstegen inom viral Vector och nanomaterial har öppnat vägen för nya banbrytande metoder för att undersöka eller manipulera centralanervsystemet (CNS). Men ytterligare optimering av dessa tekniker skulle gynnas av metoder som möjliggör snabb och strömlinjeformad bestämning av omfattningen av CNS och cellspecifik inriktning vid administrering av virala vektorer eller nanopartiklar i kroppen. Här presenterar vi ett protokoll som utnyttjar den höga genomströmningen och multiplexering kapacitet flödescytometri att möjliggöra en enkel kvantifiering av olika cell subtyper isolerade från mushjärna eller ryggmärg, nämligen microglia/makrofager, lymfocyter, astrocyter, oligodendrocyter, nervceller och endotelceller. Vi tillämpar denna metod för att belysa kritiska skillnader mellan två vävnads homogenisering metoder när det gäller cell utbyte, lönsamhet och sammansättning. Detta kan instruera användaren att välja den bästa metoden beroende på celltyp (er) av intresse och det specifika programmet. Denna metod lämpar sig inte för analys av anatomisk fördelning, eftersom vävnaden är homogeniserad för att generera en encellig suspension. Men det gör det möjligt att arbeta med livskraftiga celler och det kan kombineras med cell-sortering, öppna vägen för flera applikationer som kan utöka repertoaren av verktyg i händerna på neuroscientist, alltifrån etablering av primära kulturer som härrör från ren cellpopulationer, till gen-Expression analyser och biokemiska eller funktionella analyser på väldefinierade cell subtyper i samband med neurodegenerativa sjukdomar, vid farmakologisk behandling eller genterapi.
Introduction
Gen-och läkemedelsleverans teknik (såsom virusvektorer och nanopartiklar) har blivit ett kraftfullt verktyg som kan tillämpas för att få bättre insikter om specifika molekylära vägar förändrade i neurodegenerativa sjukdomar och för utveckling av innovativa terapeutiska metoder1,2,3. Optimering av dessa verktyg bygger på kvantifiering av: (1) omfattningen av penetration i CNS vid olika administreringsvägar och (2) inriktning av specifika cellpopulationer. Histologiska analyser används vanligtvis för att visualisera fluorescerande rapportgener eller fluorescerande-märkta nanopartiklar i olika CNS-områden och mellan olika celltyper, identifierade genom immunofärgning för specifika cell markörer4,5. Även om detta tillvägagångssätt ger värdefull information om biodistribution av den administrerade genen eller Drug-leveransverktyg, kan tekniken vara tidskrävande och arbetsintensiva eftersom det kräver: (1) vävnadsinfixering, kryopreservation eller paraffin-inbäddning och skivning; (2) färgning för specifika cellulära markörer ibland kräver antigen hämtning; (3) förvärv av fluorescensmikroskopi, som vanligtvis möjliggör analys av ett begränsat antal olika markörer inom samma experiment; (4) bildbehandling för att möjliggöra korrekt kvantifiering av signalen av intresse.
Flödescytometri har blivit en allmänt använd teknik som utnyttjar mycket specifika fluorescerande markörer för att möjliggöra inte bara en snabb kvantitativ utvärdering av olika cell fenotyper i cellsuspensioner, baserat på uttryck av yta eller intracellulära antigener, men också funktionella mätningar (t. ex. hastighet av apoptos, proliferation, cell cykel analys, etc.). Fysisk isolering av celler genom fluorescerande aktiverad cell sortering är också möjligt, vilket möjliggör ytterligare nedströms tillämpningar (t. ex. cellkultur, RNAseq, biokemiska analyser etc.) 6,7,8.
Vävnad homogenisering är ett kritiskt steg som krävs för att få en enda cellsuspension att möjliggöra tillförlitlig och reproducerbara nedströms flödescytometriska utvärderingar. Olika metoder har beskrivits för vuxna hjärnvävnad homogenisering, främst i syfte att isolera mikroglia celler9,10,11; de kan vara övergripande klassificeras i två huvudkategorier: (1) mekanisk dissociation, som använder slipning eller klippning kraft genom en Dounce Homogenisatorer (DH) att rippa isär celler från sina nischer och bildar en relativt homogeniserad enda cellsuspension, och (2) enzymatisk matsmältning, som förlitar sig på inkubation av malet vävnad bitar vid 37 ° c i närvaro av proteolytiska enzymer, såsom trypsin eller papain, gynnar nedbrytningen av den extracellulära matrisen för att skapa en ganska homogeniserad cellsuspension12.
Oavsett vilken metod som används, rekommenderas ett reningssteg efter vävnads homogenisering för att avlägsna myelin genom centrifugering på en densitetsgradient eller genom magnet val9,12, innan de övergår till nedströms applikationer.
Här beskriver vi en vävnads process metod baserad på papain matsmältningen (PD) följt av rening på en densitet gradient, optimerad för att få livskraftiga heterogena cellsuspensioner från mushjärna eller ryggmärg på ett tidskänsligt sätt och lämpar sig för flödescytometri. Dessutom beskriver vi en 9-färgton flödescytometri panel och den gating strategi vi antog i laboratoriet för att möjliggöra samtidig diskriminering av olika CNS populationer, levande/döda celler eller positivitet för fluorescerande reportrar såsom grönt fluorescerande protein eller rodamin färgämne. Genom att tillämpa denna flödescytometrisk analys kan vi jämföra olika metoder för vävnads bearbetning, dvs PD kontra DH, när det gäller bevarande av cellulär lönsamhet och utbyten av olika celltyper.
De uppgifter vi tillhandahåller häri kan instruera beslut om homogeniseringsprotokollet och antikropps kombinationen att använda i flödescytometri-panelen, baserat på den specifika celltypen (-erna) av intresse och efterföljande analyser (t. ex. temperaturkänsliga applikationer, spårning av specifika fluorescerande markörer, in vitro-kultur, funktionella analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Dana Farber Cancer Institute (protokollnummer 16-024).
1. beredning av lösningar som behövs för experimentet
- Förbered 1x Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) genom att späda 10X HBSS med sterilt vatten. Pre-Chill lösningen på is. Minst 25 mL lösning behövs för varje prov.
- Förbered isotonisk Percoll lösning (IPS) genom att blanda 10X sterila HBSS 1:10 med densitet gradient medium (dvs Percoll). Pre-Chill på is.
Anmärkning: IPS kan förvaras i upp till 30 dagar vid 4 ° c. - Förbered flödescytometri (FACS) blockering (BL) lösning (1% bovint serumalbumin [BSA], 5% foster bovint serum [FBS] i fosfatbuffrad saltlösning [PBS]). Pre-Chill på is.
2. djur dödshjälp av intrakardiell perfusion och vävnad dissektion
Notera: åtta-vecka-gammala C57BL/6J möss, endera könsbestämmer, användes i experimenten. Perfusion med PBS-lösning utförs för att eliminera blod förorening från organ, innan du fortsätter med vävnadsnedbrytning.
- Anesthetize musen med hjälp av en blandning av ketamin/xylazin (90 − 200 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazin). Placera musen på ryggen och tejpa varje lem ner till stöd. Kontrollera tillräckligt djup av anestesi genom att kontrollera tillbakadragande reflex.
- Gör en mittlinje hud snitt på nivån för thorakala inloppet att exponera bröstbenet. Använd tång för att greppa spetsen av bröstbenet, sedan göra en 1 cm snitt på vardera sidan av revbenen. Slutligen skär genom membranet och öppna bröstbenet tillräckligt mycket för att visualisera hjärtat.
- Använd tång för att försiktigt ta tag i hjärtat genom höger kammare och lyfta den till mittlinjen och något ur bröstet.
- Sätt i en 23 G fjärilnål i spetsen på vänster kammare, mot aorta och håll fast.
- Starta perfusion med 1x PBS. Tränga igenom den högra örat med hjälp av saxar så att parfymen att lämna cirkulationen. Ställ in flödeshastigheten för PBS med 3 mL/min. parfymera med minst 15 mL 1x PBS för att säkerställa att vävnaderna är tydliga.
Anmärkning: blanchering av levern och mesenteriiska blodkärl är tecken på god perfusion. Vid behov kan volymen av för fusion ökas upp tills vätskan som lämnar hjärtat är klar för blod, varvid spollinjen kan stoppas. - Efter perfusion, Sever hjärnan från ryggmärgen och ta bort hjärnan från skallen med sax och pinps. Ta bort pälsen för att öka synligheten och kontrollen under dissektion och för att undvika att bära över hår föroreningar. Spola ryggmärgen ur dess kolonn med hjälp av en 3 mL spruta fylld med PBS.
- Överför varje vävnad i en brunn av en 6-väl multi-well plattan förfylld med 2 mL iskall 1x HBSS och hålla på is tills matsmältningen.
- Dela upp hjärnan och ryggmärgen i två halvor, längs den längsgående linjen.
Anmärkning: en halv av varje vävnad homogeniseras (se avsnitten nedan) för att möjliggöra flödescytometriska analyser; den andra halvan kan hänföras till olika behandling för alternativa analyser (t. ex. doppade i PARAFORMALDEHYD fixativ lösning för histologi).
3. enzymatisk nedbrytning av hjärna och ryggmärg
Obs: volymer som beskrivs i detta avsnitt är tillräckligt för nedbrytning av en halv hjärna eller ryggmärg.
- Använd ett par sax för att finhacka vävnaderna i 1 − 2 mm tjocka bitar.
- Skär spetsen på en 1000 μL pipett med ett par sax för att göra den tillräckligt stor för att möjliggöra insamling av vävnad bitar. För sköljning av pipettspetsen med 1x HBSS. Använd sedan pipetten för att överföra 2 mL HBSS-lösning som innehåller den malda vävnaden till ett 15 mL koniskt rör.
Anmärkning: för sköljning av pipettspetsen är viktigt för att förhindra klibbighet av vävnad bitarna inuti spetsen. - Tvätta brunnen med ytterligare 2 mL iskall 1x HBSS och överför lösningen till motsvarande 15 mL koniskt rör som innehåller vävnads bitarna.
- Centrifugera varje prov i 5 min vid 250 x g vid 4 ° c.
- Förbered enzym mix 1 av neurala vävnad dissociation Kit (NTDK; Tabell över material) genom att blanda 50 μL enzym P med 1900 μL buffert X per prov. Varm Enzymblandning 1 vid 37 ° c i ett vattenbad. Inkubera enzym blandningen 1 vid 37 ° c i minst 10 min före användning för att möjliggöra full aktivering av enzymet.
- Sug upp supernatanten från det koniska 15 mL-röret och tillsätt 1,95 mL Enzymblandning 1 till varje prov. Skaka försiktigt för att se till att pelleten återsuspenderas.
- Inkubera proverna på ett hjul eller en shaker i 15 min vid 37 ° c.
- Bered under tiden enzym blandningen 2 av NTDK genom att blanda 10 μL enzym A med 20 μL buffert Y per prov. Förvärm lösningen vid 37 ° c i ett vattenbad.
- Vid slutet av inkuberingen med enzym mix 1, tillsätt 30 μL Enzymblandning 2 till varje prov.
- Blanda försiktigt proverna genom att Pipettera upp och ner med en 1000 μL pipettspets som försköljs med 1x HBSS.
- Inkubera provet på ett hjul eller en shaker i 15 min vid 37 ° c.
- Efter inkubering, tillsätt 10 mL iskall 1x HBSS till varje tub för att inaktivera enzym mix 1 och enzym Mix 2.
- Centrifugera varje prov i 10 min vid 320 x g vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten; Tillsätt iskalla 1x HBSS till varje rör upp till en slutlig volym på 7 mL och försiktigt Omsuspendera pelleten genom vortexing.
- Fortsätt till avsnitt 5 för borttagning av skräp.
4. mekanisk homogenisering av hjärna och ryggmärg
Obs: volymer som beskrivs i detta avsnitt är tillräckligt för homogenisering av en halv hjärna eller ryggmärg. Det protokoll som beskrivs i detta avsnitt kan användas som ett metod alternativ till det som beskrivs i avsnitt 3, beroende på användarbehov enligt vad som diskuteras nedan.
- Pre-Chill glaset murbruk av Dounce Tissue Grinder (tabell över material) som på is.
- Tillsätt 3 mL förkyld 1x HBSS till murbruket.
- Överför vävnaden (hjärna eller ryggmärg) från brunnen av 6-brunnen plattan i glaset murbruk se till att det doppas i 1x HBSS och sitter på botten av murbruket.
- Försiktigt krossa vävnaden med 10 slag av mortelstöt A följt av 10 slag av mortelstöt B. överför den homogeniserade blandningen till ett nytt 15 mL koniskt rör.
- Fyll röret till en slutlig volym på 10 mL genom att använda förkyld 1x HBSS och Centrifugera i 10 min vid 320 x g vid 4 ° c.
- Aspirera på supernatanten och tillsätt iskall 1x HBSS till varje rör upp till en slutlig volym på 7 mL och försiktigt Omsuspendera pelleten genom vortexing.
- Fortsätt till avsnitt 5 för borttagning av skräp.
5. borttagning av skräp
Anmärkning: avlägsnande av skräp, består huvudsakligen av osmält vävnad och myelin slidor, är ett kritiskt steg för att möjliggöra effektiv färgning av vävnaden homogena för efterföljande flödescytometriska analyser.
- Filtrera varje prov genom en 70 μm cell sil för att ta bort osmält vävnad bit. Detta steg är särskilt viktigt särskilt när man arbetar med ryggmärg vävnader eftersom dessa prover är mer benägna att innehålla osmälta nervfragment eller hjärnhinnorna som kan påverka de efterföljande stegen.
- Kontrollera att den slutliga volymen är 7 mL i varje provrör. Om inte, fyll med iskall 1x HBSS upp till 7 mL.
- Tillsätt 3 mL förkylda IPS till varje prov för att göra en slutlig volym på 10 mL av en lösning som innehåller densitetsgradientmediet vid 30% slutkoncentration. Skaka försiktigt proverna för att se till att de är jämnt blandade.
- Centrifugera prover för 15 min vid 700 x g vid 18 ° c se till att ställa accelerationen av centrifugen till 7 och bromsen till 0.
Observera: centrifugering bör ta cirka 30 minuter. - Ta försiktigt bort proverna från centrifugen.
Anmärkning: en vitaktig disk som består av skräp och myelin bör vara synlig flytande på ytan av lösningen. En pellet (som innehåller cellerna av intresse) bör vara synlig på botten av röret. - Försiktigt aspirera alla vitaktig disk av skräp och sedan resten av supernatanten se till att inte ta bort pelleten. Lämna ca 100 μL lösning ovanpå cellpelleten för att undvika risken att oavsiktligt ta bort den.
- Tillsätt 1 mL FACS BL, Omsuspendera pelleten genom att Pipettera upp och ner med en 1000 μL pipettspets och överföra proverna till 1,5 mL-rören.
- Centrifugera i 5 min vid 450 x g vid rumstemperatur (RT).
- Aspirera försiktigt supernatanten och Omsuspendera pelleten i lämplig buffert som är kompatibel med efterföljande analyser (se avsnitt 6 för det protokoll som används för flödescytometrisk utvärdering av flera celltyper).
6. färgning för flödescytometrisk utvärdering av flera celltyper
- Omsuspendera den pellet som erhållits i steg 5,9 med 350 μL FACS BL. Lägg till FC-block i varje prov med en slutkoncentration på 5 μg/mL.
Obs: minst 100 μL av provet bör användas för en färgning, för att se till att bearbeta tillräckligt med celler för att möjliggöra tillförlitliga analyser. - Inkubera provet i 10 min vid 4 ° c innan du fortsätter med infärgning.
- Bered en antikropps blandning enligt tabell 1.
- Tillsätt antikropps blandningen i varje tub, virvel för 5 s och inkubera proverna i 15 min vid 4 ° c i mörker.
- Tillsätt 1 mL PBS till varje tub, Vortex och Centrifugera i 5 min vid 450 x g vid RT.
- Under tiden Förbered konjugerat blandning enligt tabell 1.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i konjugerat-blandningen som bereds i steg 6,6. För varje prov använder du samma volym som den som används för färgning i steg 6,4.
- Vortex för 5 s och inkubera proverna i 10 minuter vid 4 ° c i mörker.
- Tillsätt 1 mL PBS till varje tub, Vortex och Centrifugera i 5 min vid 450 x g vid RT.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i FACS BL. Använd 300 μL FACS BL för varje 100 μL prov som färgas.
- Tillsätt 7-amino-Actinomycin D (7-AAD) lösning till varje prov. Använd 5 μL 7-AAD för varje 300 μL prov som bereds i steg 6,10.
- Förvara proverna vid 4 ° c i mörker tills cytofluorimetrisk analys. Utför analysen inom 16 timmar från provberedning, för att garantera > 60% cellviabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi jämförde två olika homogeniseringsmetoder (DH kontra PD) appliceras på mushjärna och ryggmärg, att testa effektiviteten i att hämta olika livskraftiga celltyper som lämpar sig för nedströms applikationer. För att göra detta utnyttjade vi en 9-färgton flödescytometri panel som utformats för att karakterisera, i samma prov, olika CNS-celltyper inklusive microglia, lymfocyter, neuroner, astrocyter, oligodendrocyter och endotelet.
Vävnader från hjärnan och ryggmärgen hämtades från olika möss (n ≥ 6), delades i två halvor i längsled, vägdes och behandlades parallellt genom att använda antingen mekaniska störningar med hjälp av Dounce-homogenisatorn (DH-metoden) eller försiktigt malet och smält enzymatiskt med hjälp av den kommersiella NTDK baserad på papain (PD-metoden) (figur 1A). Efter avlägsnande av skräp, celler från hjärnan eller ryggmärgen späddes 1/10 eller 1/2 − 1/5, respektive, i Trypan blå för att bestämma cell utbyte och lönsamhet med en Neubauer kammare (figur 1B, C). DH-metoden gav sammantaget en högre cell avkastning från både hjärna och ryggmärg. Majoriteten av cellerna som hämtades var dock döda, vilket resulterade i endast 13,8% ± 3,3% av livskraftiga celler i hjärnan och 10,5% ± 1,5% i ryggmärgen (figur 1B). Många av de döda cellerna bildas aggregat (figur 1C); Detta fenomen kan bero på närvaron av mycket sammankopplade cell nätverk (som de endoteliala och glialceller som kantar CNS-vaskulaturen) som inte kunde disaggregeras av den klippande kraft som tillämpades med DH. Dessa aggregat av dödsceller var sannolikt inte bort av densitetsgradienten och hamnade i den slutliga cellen pelleten som används för cytofluorimetrisk analys. Tvärtom, PD-metoden fastställt en övergripande bättre bevarande av cellulära lönsamhet (90,6% ± 0,6% i hjärnan och 85,2% ± 2,8% i ryggmärgen). Papain kan smälta den extracellulära matrisen och cell-till-cell korsningar effektivt, vilket leder till en mer enhetlig enda cellsuspension. Några av de celler som dör under malning processen kan ytterligare rötas av papain leder till bildandet av cell skräp som är mer effektivt separeras genom densitetsgradienten. Sammantaget har detta sannolikt fastställt en bättre bevarande av cellernas lönsamhet med PD-metoden, trots en något lägre cell avkastning jämfört med DH-metoden.
En alikvot av 100 μL från hjärn-och ryggmärgs cellsuspensioner färgas med antikropps blandningen (tabell 1) och analyserades av flödescytometri med en 9-färgspanel. Figur 2A visar den gating strategi som används för att identifiera de olika celltyper från hjärnan och ryggmärgen cellsuspensioner. Kort sagt, den första porten identifierar den allmänna befolkningen enligt Forward scatter (FSC) och Side scatter (SSC), exklusive småcellig skräp. Sedan levande (7-AAD-) celler identifieras. Inom den totala levande cellpopulationen markeras CD45 + och CD45-celler. Inom CD45 +-porten identifieras CD45 + CD11b + microglia/macrophages och CD45 + CD11b-lymfocyter. Inom CD45-Gate, är celler diskrimineras enligt positivitet för ACSA2 (astrocyter) eller O4 (oligodendrocyter). CD45-ACS2-O4-cellerna är vidare indelade efter positivitet för Thy1 (neuroner) eller CD31 (endotel). Återstående Thy1-CD31-celler klassificeras som "andra celltyper", inte redovisas av vår antikropps blandning.
Som framgår av figur 2B, med DH-metoden om 38% av de livskraftiga cellerna som hämtats från hjärnan och cirka 32% av de livskraftiga cellerna som hämtades från ryggmärgen var av hematopoietiskt ursprung (CD45 +). Å andra sidan, PD-metoden får hämta en signifikant hög avkastning av livskraftiga celler i båda vävnaderna, med en mycket stor fraktion representeras av icke-hematopoietiska CD45-celler (om 82% i hjärnan och 92% i ryggmärgen). Anmärkningsvärt nog representerade CD45 + CD11b + microglia/macrophages den vanligast förekommande livskraftiga cell fraktionen med DH-metoden (figur 2C). Men PD-metoden gav en mer heterogen representation av celltyper, inklusive ACSA + astrocyter, O4 + oligodendrocyter, CD31 + endotelceller och Thy1 + neuroner (figur 2C). Intressant nog var livskraftiga nervceller och endotelceller knappast detekterbara med DH-metoden.
DH-metoden förlitar sig på mekanisk slipning av vävnaden mellan glas stöt och murbruk av Dounce Homogenisatorer för att få vävnad homogenisering. Detta kan orsaka vissa skjuvning stress som sannolikt kommer att skada och påverka lönsamheten för stora eller mycket känsliga celler såsom nervceller eller celler i neurovaskulaturen. Vi utvärderade cellernas lönsamhet (procentandel av 7-AAD-celler) inom varje cell delpopulation som identifierats genom antikropps panelen (figur 3). Hematopoietiska celler (CD45 +) isolerade från hjärna och ryggmärg, inklusive mikroglia/makrofager (CD45 + CD11b +) och andra icke-myeloida celler (CD45 + Cd11b-), uppvisade mycket hög lönsamhet oberoende av den homogeniseringsmetod som användes (figur 3A). Tvärtom fastställde DH-metoden en signifikant minskning av lönsamheten för CD45 populationer (figur 3B) medan PD-metoden fastställde ett omfattande bevarande av olika CNS-celltyper. I detalj var nervceller och endotelceller de subpopulationer som påverkades mest av DH och som bevarades av PD-metoden.
En schematisk presentation av de kritiska steg som krävs för korrekt provberedning och effektiv borttagning av skräp sammanfattas i figur 4.
Figur 1: utbyte av celler som hämtats från hjärna och ryggmärg påverkas av homogeniseringsmetoden.
A) experimentell kontur. Möss var sövda och intracardiacally parfymera med PBS att ta bort intravaskulära cirkulerande blodkroppar. Hjärnan och ryggmärgen var noggrant dissekeras och delas i två halvor longitudinellt. Vävnader var homogeniserade med antingen Dounce Homogenisatorer (DH) eller papain matsmältningen (PD) som beskrivs i huvudtexten. Myelin och vävnad skräp avlägsnades sedan genom centrifugering i en 30% densitet gradient medium lösning som resulterar i en heterogen cellsuspension som innehåller olika celltyper som kan analyseras med flödescytometri. Bhistogram som visar utbytet av celler som hämtats från hjärnan eller ryggmärgen vid vävnads homogenisering med DH-eller PD-metoden. Medelvärdet ± SEM på minst 6 djur per tillstånd representeras. C) representativa brightfield Mikroskop mikrofotografier av trypan blå positiva (döda) och negativa (levande) celler hämtade från hjärna eller ryggmärg med de två metoderna. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: relativa proportioner av olika celltyper som hämtats från CNS påverkas av vävnads homogeniseringsmetoden.
A) representativa flödescytometritomter som visar den strategi för att identifiera olika cell subpopulation inom cell preparat som erhållits från hjärna eller ryggmärg: cellpopulationen är gated på FSC och SSC fysikaliska parametrar, följt av urval för 7-AAD-Live-celler; därefter diskrimineras celler enligt positivitet för CD45 markör; mikroglia/makrofager identifieras som CD11b + celler inom CD45 + fraktion medan lymfocyter är CD11b-. Astrocyter, oligodendrocyter, endotelceller och neuronala celler identifieras som ACSA2 +, O4 +, CD31 + eller Thy1 + celler inom CD45-, respektive. Bhistogram som visar andelen CD45 + och CD45-celler inom totalt levande eller döda cellpopulationer, i hjärna eller ryggmärg vid HOMOGENISERING med DH-eller PD-metoden. Den statistiska analysen av de resultat som visas i diagrammen rapporteras i tabell 2. C) cirkeldiagram som visar andelen olika livskraftiga cell subtyper inom den totala cellpopulationen, i hjärna eller ryggmärg vid homogenisering med DH-eller PD-metoden. Procentandelen av totala döda celler rapporteras också. N ≥ 6. CD45 + CD11b + = microglia/makrofager; CD45 + CD11b-= lymfocyter/icke-myeloida celler; CD45-ACSA2 + = astrocyter; CD45-O4 + = oligodendrocyter; CD45-Thy1 + = neuroner; CD45-CD31 + = endotelceller; Andra = celler negativa för alla ovan nämnda markörer. Den statistiska analysen av de resultat som visas i diagrammen rapporteras i tabell 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: cellernas livskraft hos olika CNS-celltyper påverkas av den homogeniseringsmetod som tillämpas.
(A) histogram som visar andelen 7-AAD-Live-celler inom CD45 + hematopoietiska populationer, inklusive CD11b + microglia/makrofager och CD11b-icke-myeloida celler. (B) histogram som visar andelen 7-AAD-Live-celler inom CD45-icke-hematopoietiska populationer inklusive astrocyter, oligodendrocyter, nervceller, endoteliala och andra celltyper. * = p < 0,05, * * = p < 0,01, Mann-Whitney mellan DH och PD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: schematisk representation av de kritiska steg som krävs för korrekt vävnads bearbetning.
En lista över de mest kritiska steg som krävs för korrekt vävnads bearbetning och effektivt avlägsnande av skräp visas. Det är viktigt att korrekt identifiera fragmentskivan (svart pil) och cell pelleten (blå pil) bildas efter centrifugering av proverna på 30% densitet gradient. Fragmentskivan, tillsammans med resten av supernatanten, måste noggrant avlägsnas genom aspiration utan att göra cell pelleten ogenomtänkt för att undvika prov förlust. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikropps blandning | Initial koncentration (μg/mL) | Slutlig koncentration (μg/mL) | Utspädningsfaktorn |
| anti CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD11b/APC. 780 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| anti ACSA2/APC | 150 | 0,75 | 200 |
| anti O4/biotin | Na | Na | 40 |
| anti-CD 90.2/PE. Cy7 | 200 | 2 | 100 |
| Streptavidin blandning | Initial koncentration (μg/mL) | Slutlig koncentration (μg/mL) | Utspädningsfaktorn |
| Streptavidin/Alexa 680 | 1000 | 1 | 1000 |
Tabell 1: recept för beredning av blandningar för flödescytometri färgning. Tabellen beskriver optimala koncentrationer av antikroppar och konjugerat används för att tillåta flödescytometriska analyser av flera celltyper. Se tabell över material för information om katalognummer för varje reagens som nämns i tabellen.
| Statistik för diagram 2B | ||||||||||
| HJÄRNA (% celler) | ||||||||||
| CD45 + | CD45 | |||||||||
| Live | Döda | Live | Döda | |||||||
| Metod | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | ||
| Dh | 15,20 | ± 2,32 | 1,90 | ± 0,30 | 24,78 | ± 4,045 | 51,58 | ± 6,033 | ||
| Pd | 15,20 | ± 2,65 | 2,33 | ± 1,10 | 68,53 | ± 3,618 | 13,93 | ± 2,180 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p-värde | 0,9989 | 0,738 | 0,0006 | 0,0015 | ||||||
| RYGGMÄRG (% celler) | ||||||||||
| CD45 + | CD45 | |||||||||
| Live | Döda | Live | Döda | |||||||
| Metod | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | ||
| Dh | 15,00 | ± 8,21 | 1,41 | ± 0,11 | 31,64 | ± 8,21 | 51,95 | ± 16,52 | ||
| Pd | 7,49 | ± 4,99 | 1,15 | ± 0,68 | 84,27 | ± 9,39 | 7,09 | ± 3,75 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p-värde | 0,5548 | 0,7236 | 0,0438 | 0,1144 | ||||||
| Statistik för diagram 2C | |||||||||||||||||
| HJÄRNA (% celler) | |||||||||||||||||
| CD45 + | CD45 | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andra | Döda | ||||||||||
| Metod | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | |
| Dh | 19,32 | ± 3,88 | 1,17 | ± 0,27 | 9,52 | ± 2,68 | 3,41 | ± 1,01 | 1,39 | ± 0,77 | 0,48 | ± 0,29 | 10,52 | ± 4,49 | 53,83 | ± 5,79 | |
| Pd | 10,88 | ± 2,03 | 1,65 | ± 0,48 | 8,17 | ± 2,66 | 6,54 | ± 0,76 | 6,37 | ± 1,76 | 8,27 | ± 1,25 | 33,28 | ± 6,34 | 23,72 | ± 5,31 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p-värde | 0,1206 | 0,4819 | 0,5894 | 0,0264 | 0,0093 | 0,0003 | 0,0084 | 0,0022 | |||||||||
| RYGGMÄRG (% celler) | |||||||||||||||||
| CD45 + | CD45 | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andra | Döda | ||||||||||
| Metod | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | Menar | ± SEM | |
| Dh | 21,23 | ± 6,25 | 2,51 | ± 0,57 | 4,26 | ± 2,34 | 9,40 | ± 1,89 | 2,82 | ± 1,51 | 0,97 | ± 0,50 | 22,74 | ± 9,04 | 35,28 | ± 1,89 | |
| Pd | 9,63 | ± 1,67 | 2,77 | ± 0,48 | 4,23 | ± 1,59 | 28,62 | ± 3,57 | 1,26 | ± 0,49 | 6,94 | ± 2,14 | 26,39 | ± 8,17 | 19,09 | ± 4,76 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p-värde | 0,1905 | > 0.9999 | 0,7302 | 0,0159 | 0,7302 | 0,0317 | 0,7302 | 0,1111 | |||||||||
Tabell 2: statistisk analys av olika populationer som hämtats genom tillämpning av DH-eller PD-metoden. Tabellen beskriver statistiken för diagrammen som visas i figur 2B och figur 2C. Genomsnittet och SEM av åtminstone sex oberoende prov föreställs. P-värdet och detaljerna för det statistiska test som tillämpas för varje jämförelse rapporteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskriver vi ett protokoll för samrening och samtidig flödescytometrisk analys av några av de mest relevanta CNS-cellerna från mushjärna och ryggmärg. Traditionellt har histologiska analyser tillämpats för att beskriva distributionen av nanopartiklar eller verkningsgraden hos virala vektorer i CNS5,13, eller för att ge insikter om morfologiska och molekylära förändringar som förekommer i specifika celltyper under en patologi eller vid farmakologisk behandling14. Emellertid, histologi saknar processivitet och det tillåter inte omfattande undersökning av flera funktioner i samma histologiska prover, på grund av det begränsade antalet markörer som kan analyseras samtidigt. Vårt tillvägagångssätt kan vara ett komplement till traditionella histologiska analyser och det kan kombineras med flera underordnade tillämpningar (sortering, primär kultur, biokemiska eller nästa generations sekvenserings analyser) för att utöka sammanställningen av information som kan erhållas från enskilda prover. Dock måste vissa nyckelfaktorer som listas nedan betraktas som de kan kritiskt påverka framgången för detta tillvägagångssätt:
- Mängden start vävnad. Vi har optimerat cell separationen till att börja med så lite som halva ryggmärgen eller halva hjärnan. Enligt vår erfarenhet, bearbetning halv hjärna eller halv ryggmärgen från en vuxen 8-veckors gammal mus med PD-metoden ger 1 − 6 x 106 livskraftiga celler från hjärnan och cirka 0,1 − 0.5 x 106 livskraftiga celler från ryggmärgen efter densitetsgradienten steg. Vi har inte mätt celler avkastning efter tillämpning av PD-metoden på vävnader från nyfödda eller möss yngre än 8 veckor. Men i våra händer, är resultatet proportionellt mot vikten av den Start vävnad. Således, för yngre djur (t. ex., 10-dagars gamla valpar) hela hjärnan eller ryggmärgen bör bearbetas för att garantera en bra cell utbyte för tillförlitlig nedströms analyser. Om det behövs, samla vävnader från flera djur skulle bidra till att öka cell avkastningen. Enligt vår erfarenhet, detta protokoll kan också tillämpas utan ändringar för att isolera celler från hjärnan eller ryggmärgen av råttor, när det gäller andelen reagenser som används per vikt av start vävnad respekteras. För vävnader mer än 250 mg vikt, skala reagenser upp eller dela vävnad i flera prover (varje viktning < 250 mg) föreslås.
- Ta bort hjärnhinnorna/rester vävnad bitar före densitetsgradienten. Enligt vår erfarenhet, PD-metoden beskrivs härmed inte kan smälta effektivt hjärnhinnorna eller mycket mycket myeliniserade vävnader såsom nerver och nervrötter som uppstår från ryggmärgen. När dessa vävnader är närvarande, vissa osmält klibbiga bitar kan finnas kvar i cellsuspensionen hämtas efter enzymatiska digestionssteg, innan avlägsnande av skräp. Att ta bort dessa segment genom att filtrera lösningen genom en cell-SIL 70 μm (som föreslås i steg 5,1) är avgörande för en lyckad cell beredning. I själva verket, om inte avlägsnas, hjärnhinnorna eller bitar vävnad kommer att hindra effektiv densitet gradient separation vilket resulterar i dålig cell avkastning.
- Tidpunkt, temperatur och sterilitet. Det är mycket viktigt att utföra alla steg i tid sätt med rätt temperaturinställningar och inkuberingar som föreslagits. Detta är avgörande för att säkerställa hög cellernas lönsamhet och integritet av provet. Beroende på nedströmsapplikationen kan det vara nödvändigt att utföra alla steg under en steril huva och med sterila reagenser (t. ex. etablera primära cellkulturer). Förlängd inkubering i den enzymatiska matsmältnings lösningen bortom den föreslagna tiden (avsnitt 3) kan resultera i en droppe cell lönsamhet. De epitoper av vissa ytantigener kan vara känsliga för papain vilket resulterar i förlust av signalen vid flödescytometri. För specifika program som kräver ytterligare markörer än de som beskrivs i denna artikel, rekommenderas testning av prestanda för olika antikroppkloner innan experimentet påbörjas. Det har rapporterats att densitetsgradienten mediet kan innehålla några spår av endotoxiner som kan utlösa aktivering av immunceller (microglia/makrofager). Lämpliga interna kontroller bör alltid läggas till i experimenten när dessa populationer analyseras, för att utesluta möjliga effekter som induceras av förfarandet. Stickning med de föreslagna temperaturerna och tvätt densitet gradient medium rester omedelbart efter skräp-avlägsnande steg är oftast tillräckligt för att undvika öppen immunceller aktivering. Men om nedströmsapplikationerna (t. ex. RNAseq eller funktionella analyser) påverkas av detta steg, bör användaren byta till en låg endotoxin densitet gradient medium beredning (föreslås i tabell över material).
- FACS antikroppar och maskin. Det flödescytometrifärgningsprotokoll som härmed presenteras använder sig av antikropps koncentrationer och färgkonjugationer som fungerade bäst med cell utbyten hämtade i vår laboratorie erfarenhet och med FACS-maskiner tillgängliga i vårt institut. Användaren bör titer antikropparna i hans/hennes händer innan du påbörjar ett nytt experiment, eftersom koncentrationen kan behöva justeras något. Dessutom uppmuntrar vi att använda alltid enfärgade färgning kontroller i varje experiment för att kontrollera att alla antikroppar och kompensation uppsättning av FACS maskinen fungerar på ett adekvat sätt. Det måste noteras att CD90 (Thy) antigen som används för att upptäcka nervceller finns i två olika isotyper, nämligen CD 90.2 eller CD 90.1 beroende på musen stam: de vanligaste mus stammar, såsom C57BL6/J Express CD 90.2; mus stammar som AKR/J, PL och FVB/N Express CD 90.1. Sålunda, användaren bör noggrant kontrollera musen stam och välja lämplig anti-CD90 antikropp (som föreslås i tabell över material) innan experimenten.
Sammanfattnings, protokollet här presenteras utnyttjar en mild enzymatisk matsmältning följt av en 9-färg färgning möjliggör effektiv samtidig flöde kors utvärdering av olika celltyper från mushjärna och ryggmärg. Protokollet skulle kunna utnyttjas för att på ett rationalt och heltäckande sätt övervaka effektiviteten i cell inriktningen genom nanopartiklar eller virusvektorer som administreras i CNS15. Dessutom skulle protokollet lätt kunna antas för mycket känsliga nedströms tillämpningar, såsom cell sortering, ex vivo subkultur, Single cell RNAseq, vilket är ett resultat av yttersta vikt inte bara för preklinisk bedömning av cellinriktning av Therapeutics utan även för djupgående karakterisering av patologiska processer i neurodegenerativa sjukdomar.
En bråkdel av hela CNS-cellpopulationen diskrimineras inte i detta protokoll (se "andra" celltyper i figur 2). Detta kan förklaras av närvaron av andra cell subtyper som finns i CNS, men fångas inte av de antikroppar som vi använde. I våra preliminära analyser, om 14% av "andra celler" fraktion är positivt för CD73, en mesenkymala cell markör berikas i neurovaskulaturen och involverade i flera neuroinflammatoriska processer16,17. Dessutom, vi hypotes att "andra celler" fraktion kan också bestå av mindre differentierade celler, som stamceller i olika stadier av mognad, såsom nestin + neurala stamceller, nestin + vimentin + Radial glia föregångare, doublecortin + neurala progenitorer, NG2 + oligodendrocyte prekursorer celler, bland annat. Dessa cell undertyper kan lätt undersökas genom att tillämpa vårt flöde flödescytometrianalys protokoll, eftersom vi valde en konfiguration av fluorescerande färgämnen som gör det möjligt att rymma upp till två ytterligare cell markörer konjugerat med antingen fluorescein isotiocyanat (FITC) eller phycoerythrin (PE) fluoroforer.
Sammantaget skulle vår strategi kunna ge ett nytt verktyg för mer omfattande utredningar inom ramen för CNS (i hälsa och sjukdom) att dra nytta av en väl sammanställd teknik som möjliggör både kvalitativa och hög genomströmning kvantitativa bedömningar såsom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av Boston Children ' s Hospital start-up fonder till A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 till M.P., och kontoret för biträdande försvarsministern för hälsofrågor genom Amyotrofiska lateral skleros forsknings program under Award No. W81XWH-17-1-0036 till M.P. Vi erkänner DFCI Flow Cytometry Core för teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
