En decentraliseret (ex vivo) murine blære model med detrusor musklen fjernet for direkte adgang til Suburothelium under blære fyldning
Summary
Den detrusor-fri blære model giver direkte adgang til suburothelium at studere lokale mekanismer til regulering af biologisk aktive mediator tilgængelighed i suburothelium/lamina propria under oplagring og tømning af urin. Præparatet minder meget om påfyldning af en intakt blære og tillader, at der udføres tryk volumen undersøgelser uden systemisk påvirkning.
Abstract
Tidligere undersøgelser har etableret frigivelse af kemiske stoffer fra flade blære slimhinde ark anbragt i Ussing kamre og udsat for ændringer i hydrostatisk tryk eller mekanisk strækning og fra dyrkede urotheliale celler ved hydrostatiske trykændringer, stræk, celle hævelse, eller trække kræfter, og i blæren lumen ved slutningen af påfyldning. Sådanne fund førte til den antagelse, at disse mæglere også frigives i suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) under blære fyldning, hvor de påvirker celler dybt i blære væggen til i sidste ende regulere blære ophidelse. Der er mindst to indlysende begrænsninger i sådanne undersøgelser: 1) ingen af disse tilgange giver direkte oplysninger om tilstedeværelsen af mæglere i SubU/LP, og 2) de anvendte stimuli er ikke fysiologiske og ikke rekapitulere autentisk fyldning af blæren. Her diskuterer vi en procedure, der giver direkte adgang til suburothelial overflade af blære slimhinden i løbet af blære fyldningen. Den murine detrusor-fri forberedelse vi skabt tæt ligner påfyldning af den intakte blære og tillader tryk-volumen undersøgelser, der skal udføres på blæren i fravær af forstyrrende signalering fra spinal reflekser og detrusor glatte muskler. Ved hjælp af romanen detrusor-fri blære model, vi for nylig påvist, at intravesikal målinger af mæglere ikke kan bruges som en proxy til, hvad der er blevet frigivet eller til stede i SUBU/lp under blære fyldning. Modellen muliggør undersøgelse af urothelium-afledte signalerings molekyler, der frigives, genereres ved metabolisme og/eller transporteres ind i SubU/LP i løbet af blære fyldning for at transmittere oplysninger til neuroner og glat muskulatur i blæren og regulere dens ophidelighed under kontinens og vandladning.
Introduction
Formålet med denne model er at give direkte adgang til submucosavævet side af blære slimhinde under forskellige faser af blære påfyldning.
Blæren skal afstå fra for tidlig sammentrækning under påfyldning og tomt, når kritisk volumen og tryk er nået. Unormal kontinens eller tømning af urin er ofte forbundet med unormal ophidning af detrusor glatte muskulatur (DSM) i løbet af blære fyldning. Excitabilitet af DSM bestemmes af faktorer iboende til de glatte muskelceller og af påvirkninger genereret af forskellige celletyper i blære væggen. Væggen af urinblæren består af har (slimhinde), suburothelium (SUBU)/lamina propria (LP), detrusor glatte muskulatur (DSM) og serøse hinder (figur 1a). Har består af paraply celler (dvs. det yderste lag af har), mellemliggende celler og basal celler (dvs. det inderste lag af har). Forskellige typer af celler, herunder interstitiel celler, fibroblaster, afferent nerve terminaler, små blodkar, og immunceller bor i SubU/LP. Det er almindeligt antaget, at blæren har er et sensorisk organ, der indleder refleks vandladning og kontinens ved at frigive mæglere i submucosa, der påvirker cellerne i SUBU/lp og DSM1,2,3. For det meste er sådanne antagelser baseret på undersøgelser, der har påvist frigivelse af mæglere: fra stykker af slimhinder udsat for ændringer i hydrostatisk tryk4,5; fra dyrkede urotheliale celler udsat for stretch6,7, hypotonicity-induceret celle hævelse7 eller trække kræfter8; fra isolerede blære væg strimler ved receptor eller nerve aktivering9,10,11,12,13,14; og i blæren lumen i slutningen af blæren påfyldning15,16,17,18,19. Mens sådanne undersøgelser var medvirkende til at demonstrere frigivelse af mæglere på mekanisk stimulering af blære væg segmenter eller dyrkede urotheliale celler, de har brug for at blive understøttet af direkte beviser for frigivelse af mæglere i submucosa, der er fremkaldt af fysiologiske stimuli, der gengiver blære påfyldning. Dette er en udfordrende opgave, da SubU/LP er placeret dybt i blære væggen hæmmer den ligetil adgang til nærheden af SubU/LP under blære fyldning.
Her illustrerer vi en decentraliseret (ex vivo) murine blære model med detrusor muskel fjernet13 , der blev udviklet for at lette undersøgelser af lokale mekanismer af mekanisotransduktion, der deltager i signalering mellem blæren UROTHELIUM, DSM og andre celletyper i blære væggen. Denne fremgangsmåde er bedre end at bruge flad blære Vægplader, blære væg strimler eller kulturperler urotheliale celler, fordi det giver mulighed for direkte målinger i nærheden af SubU/LP af urothelium-afledte mediatorer, der frigives eller dannes som reaktion på fysiologiske belastninger og volumener i blæren og undgår potentielle fænotypiske ændringer i cellekultur. Det kan bruges til at måle tilgængelighed, frigivelse, metabolisme og transurothelial transport af mæglere i SubU/LP på forskellige stadier af blære fyldning (figur 1b). Præparatet kan også anvendes til at undersøge urothelialt signalering og mekanisotransduktion i modeller af overaktiv og under aktiv blære syndromer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blæren har to funktioner: opbevaring og tømning af urin. Normal drift af disse funktioner kræver korrekt mekanisk sensing af intraluminal volumen og tryk og transduktion af signaler gennem celler i blære væggen til at regulere detrusor muskel excitabilitet. Blæren slimhinde (urothelium) menes at regulere blære ophidelse ved at frigive en række signalering molekyler i SubU/LP, der påvirker talrige celletyper i blære væggen. I øjeblikket er de fleste forsøg på karakterisering af urothelium-afledte mediatorer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institute of diabetes og fordøjelses-og nyresygdomme Grant DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
