Summary
デトルソールフリー膀胱モデルは、サブグロテリウムへの直接アクセスを可能にし、尿の貯蔵および空洞化中にサブロテリウム/ラミナ・プロプリアにおける生物学的に活性なメディエーターの可用性を調節するための局所メカニズムを研究する。調製物は、無傷の膀胱の充填によく似ており、全身的な影響を受けずに圧力量の研究を行うことができます。
Abstract
これまでの研究では、Ussingチャンバーに貼られた平らな膀胱粘膜シートからの化学物質の放出を確立し、静水圧または機械的ストレッチの変化、静水圧変化、ストレッチ、細胞腫脹、またはドラッグ力、および充填終了時の膀胱内腔における培養尿道細胞の変化にさらされています。このような知見は、これらのメディエーターが膀胱充填中にスグロテリウム(SubU)/ラミナプロプリア(LP)にも放出され、膀胱壁の深部の細胞に影響を与え、最終的に膀胱の興奮性を調節するという仮定につながった。このような研究には少なくとも2つの明白な制限があります:1)これらのアプローチのいずれもSubU/LPにおけるメディエーターの存在に関する直接的な情報を提供せず、2)使用される刺激は生理学的ではなく、膀胱の本物の充填を再現しません。ここでは、膀胱充填の過程で膀胱粘膜の皮下表面に直接アクセスできるようにする手順について議論する。私たちが作成したマウスのデトルッサーフリー製剤は、無傷の膀胱の充填によく似ており、脊髄反射および脱離滑筋からの混乱シグナル伝達がない場合に膀胱に対して圧力量の研究を行うことができます。新しいデトルッサーフリー膀胱モデルを用いて、我々は最近、メディエーターの静脈内測定は、膀胱充填中にSubU/LPに放出または存在したものへのプロキシとして使用できないことを実証した。このモデルは、放出され、代謝によって生成され、膀胱充填の過程でSubU/LPに輸送され、膀胱のニューロンおよび平滑筋に情報を伝達し、減衰および興奮の間にその興奮性を調節する尿黒体由来シグナル伝達分子の検査を可能にする。
Introduction
このモデルの目的は、膀胱充填の異なる段階の間に膀胱粘膜の粘膜下側への直接アクセスを可能にすることです。
膀胱は充填時の早期収縮を控え、臨界体積と圧力に達すると空にしなければならない。尿の異常な大腸または空洞化は、膀胱充填の過程でデトルッサー平滑筋(DSM)の異常な興奮性にしばしば関連する。DSMの興奮性は、平滑筋細胞に固有の因子および膀胱壁内の異なる細胞型によって生成される影響によって決定される。尿膀胱の壁は、尿肉腫(粘膜)、スグロテリウム(SubU)/ラミナプロプリア(LP)、脱石平滑筋(DSM)およびセローザからなる(図1A)。尿黒周体は、傘細胞(すなわち、尿黒体の最も外側の層)、中間細胞、および基底細胞(すなわち、尿黒体の最も内側の層)からなる。間質細胞、線維芽細胞、椎間神経末端、小血管、免疫細胞など、様々な種類の細胞がSubU/LPに存在する。膀胱尿経皮は、SubU/LPおよびDSM1、2、3の細胞に影響を与える粘膜下にメディエーターを放出することによって反射反射のミチュレーションおよび大腸を開始する感覚器官であると広く仮定される。ほとんどの場合、このような仮定はメディエーターの放出を実証した研究に基づいています:静水圧4、5の変化にさらされた粘膜の断片から。ストレッチ6、7、低トニシティ誘発細胞腫脹7またはドラッグ力8に曝露された培養尿道細胞から;受容体または神経活性化時に分離された膀胱壁ストリップから9,10,11,12,13,14;膀胱充填の末端の膀胱内腔15、16、17、18、19.このような研究は、膀胱壁セグメントまたは培養尿中細胞の機械的刺激時にメディエーターの放出を実証するのに役立ったが、膀胱充填を再現する生理的刺激によって引き起こされる粘膜下のメディエーターの放出に関する直接的な証拠によって支持される必要がある。これは、SubU/LPが膀胱の充填中にSubU/LPの近くに簡単にアクセスするのを妨げる膀胱壁の深部に位置していることを考えると、挑戦的な作業です。
ここでは、膀胱の尿経骨、DSMおよび膀胱壁の他の細胞型との間のシグナル伝達に関与するメカノトランス誘導の局所的メカニズムに関する研究を容易にするために開発されたデトルター筋肉除去13を有する分散型(ex vivo)マウス膀胱モデルを例示する。このアプローチは、膀胱内の生理学的圧力および体積に応じて放出または形成される尿黒皮由来メディエーターのSubU/LP付近での直接測定を可能にし、細胞培養における潜在的な表形の変化を回避するため、平らな膀胱壁シート、膀胱壁ストリップまたは培養尿中細胞を使用する場合に優れています。これは、膀胱充填の異なる段階でSubU/LPにおけるメディエーターの可用性、放出、代謝および経尿中輸送を測定するために使用することができる(図1B)。調製物はまた、過活動および不活発膀胱症候群のモデルにおける尿動脈シグナル伝達およびメカノトランスクションを調べるために使用することができる。
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Protocol
この原稿に記載されている動物に関するすべての手続きは、ネバダ大学の国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドと制度的な動物使用とケア委員会に従って行われました。
メモ:ここで提示されるモデルは、尿路およびSubU/LPがそのまま残っている間に除出し筋肉の除去から成り立っている(図1B)。
1. デトルッサーフリー膀胱製剤の解剖
- 単離した膀胱を冷たい(10°C)で満たされた解剖皿に入れ、5%CO2/95%O2クレブス重炭酸溶液(KBS)で酸素化し、次の組成(mM):118.5 NaCl、 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 デキストロース, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
- 孤立した膀胱のドームの小さな部分を、KBSで満たされたシルガードで覆われた解剖皿にピン留めします。ピンが、SubU/LPに面する筋肉の最も内側の端から遠く離れた、セローザまたはデトルッサー筋肉の最も外側の端を通過することを確認します。
- 顕微鏡を使用して、尿道と尿管を識別し、それらのそれぞれを解剖皿の底に固定します。
- 膀胱の全身、尿道、両方の尿管が表示されるように、余分な脂肪および結合組織を取り除きます。
- 6-0ナイロン縫合糸で尿管を結びます。次に、解剖皿の底に向かって尿管の開いた端を固定し、準備を確保します。
- 細かい先端鉗子を使用して、尿管と膀胱体の間の角で静かにセローザの一部を引っ張ります。
- 透明度を高め、脱筋肉の下の粘膜下のマージンを区別するために顕微鏡の光を調整します。
- デトルッサー筋層の内面に沿って細かい先端のはさみで膀胱壁を切断し始め(剥離しない)と、カットセグメントを準備からそっと引き離します。常に、粘膜の横端が見えるようにし、それに触れないようにしてください。
- 分解皿を回してデトルソー筋肉を完全に取り除き、準備の位置が脱気筋を解剖し続けることを快適にします。
- 膀胱ドームの上に小さなデトルソル筋肉を残して、プロトコルの残りのステップ中に準備を固定する能力を確保します。
- 6-0ナイロン糸のダブルループを作り、膀胱の準備の首の周りに置き、ループを緩めたままにします。
- 6-0シルク糸の2番目の二重ループを追加し、膀胱の準備の首の周りに置き、ループが失われたままにします。縫合糸を2つ持つことは縫合糸のまつれの漏れを防ぐ。
- 20 PEチューブ(カテーテル)の約2cmをカットし、炎に近い先端をゆっくりと動かして先端を燃やします。
- カテーテルに温かい(37°C)酸素化されたKBSを充填します。
- カテーテルを膀胱尿道のオリフィスに挿入し、カテーテル先端が膀胱のおよそ真ん中に達するまでカテーテルを軽く押します。
- カテーテルの周りの縫合糸と膀胱頸部の周囲の組織を結びます。
- 約50~100μLの暖かい(37°C)の酸素化KBSで膀胱をゆっくりと満たし、KBSの表面上で短時間(<10s)持ち上げ、縫合糸と膀胱体の漏れを監視します。
- 漏れが認められない場合は、実験の準備が整います。縫合糸の周りに漏れが見られた場合は、縫合糸を取り外して交換してください。膀胱体の穴からの漏れが気付いた場合は、準備を破棄します。
2. 緻密膀胱製剤の充填
- 水(37°)の3 mL室にシルガードの底を付けたジャケットオルガン皿にKbS(37°)をパーフューズ。
- 酸素および吸引ラインを調節しなさい。
- うなじの膀胱の準備を部屋に入れ。
- カテーテルをチャンバーの側面に固定し、調製物が灌流液の表面の上に浮かばないようにします。
- 膀胱カテーテルを、同じサイズのフィッティングを使用して3方向ストップコックに接続された長いPE20チューブ(注入ライン)に接続します。
- 注入ポンプ、圧力トランスデューサ、膀胱の間の線が開いていることを確認します。
- 注入注射器に新鮮で暖かい(37°C)と酸素化されたKBSを充填します。
- ポンプパラメータを調整する:シリンジのタイプ/体積(すなわち、1 mL)、操作(すなわち注入)、流れ(すなわち、一定)、および流量(すなわち、15 μL/分)。
- シリンジポンプのスタートボタンを押して膀胱を埋めます。
- 膀胱充填中の充填量と静脈内圧を監視します。
3. 緻密膀胱製剤のSubU/LP様におけるメディエーターの検出
- 氷冷マイクロ遠心管または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)インサートに浴液のアリコートを収集します。
- 適切な検出アプリケーションに従ってサンプルを準備し、処理します。プリンの利用可能性を検出する場合は、蛍光検出13、18でHPLCによりサンプルを処理する。
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Representative Results
マウスデトルッサーフリー膀胱調製物の壁はそのままであり、DSMおよびセロサを除くすべての層を含む。原理実証研究は、DSMフリー膀胱壁に尿座とSubU/LPが含まれており、ツニカ筋肉およびセロサが存在しない(図2)13であることを実証した。
デトルッサーフリー膀胱の充填は、正常膀胱充填に近似する。図3は、異なる充填速度、体積および内圧でex vivo膀胱製剤を充填するための実験セットアップの概略を示す。マウスex vivoはそのままで、緻密な膀胱製剤は、空隙圧力13に達するために幅広い充填量を必要とする。圧力と体積の関係は、無傷の準備と緻密な準備 (ムービー 1、ムービー 2、および図 4)で著しく類似しています。したがって、DSMフリー製剤は、膀胱メカノセンセーションおよびメカノトランスダクションにおける尿黒糸およびSubU/LPの役割の機能的研究に適している。
デトルッサーフリー膀胱モデルの可能な使用
膀胱充填時の膀胱内腔および SubU/LP におけるメディエーターの利用可能性の測定
膀胱圧をモニタリングしながら膀胱製剤の充填中に外ルミナル(EL;例えば、SubU/LP)および内ルミナル(IL)サンプルを収集するための実験的セットアップを図5に示す。充填時にSubU/LP側に放出される尿体由来メディエーターを測定するためのモデルの適合性は、プリンメディエーターの放出を測定することによって試験された(例えば、 アデノシン5'-三リン酸、ATP;アデノシン5'-二リン酸、ADP;ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、NAD;アデノシン5'-一リン酸、AMP;およびアデノシン、ADO)を非ヌード製剤のSubU/LPを浴び液中に溶解する溶液中で。図6Aに示すように、無傷のDSMを有する単離された膀胱調製物を含む浴中でごくわずかな量のプリンが検出されたのに対し、これらのプリンの量は、緻密な膀胱製剤を含む浴から採取されたサンプルにおいて有意に高かった(図6B)。特に、充填終了時にルーメンとSubU/LPから採取したサンプル中のプリンおよび代謝物の分布は有意に異なった(図6C)。
膀胱充填中のSubU/LPにおけるメディエーターの細胞外代謝を調べる
ATPの高蛍光類似体を添加し、1、N6-エテノATP(εATP)をデトルソールフリー製剤のサブウロテリエーショナル側に添加すると、εATPの減少とεATP産物εADP、εAMP、εADOの増加をもたらした(図7Aaおよび図7Ab)。同様に、調製ルーメンにεATPを添加すると、εATPの減少と、内腔におけるεADP、εAMP、εADOの増加をもたらした(図7Baおよび図7Bb)。したがって、このモデルは、膀胱充填時の尿黒糸の両側の生理活性メディエーターの代謝の研究に適している。
膀胱充填中のメディエーターの経尿期輸送を調べる
緻密な調製物のSubU/LP側にεATPを添加すると、内腔内にεAMP、εADOおよびεADPが出現し、プリンがSubU/LPからルーメン13に輸送できることを示唆した(図7Ac)。同様に、ルーメンに εATP を追加すると、SubU/LP13に εAMP と εADO が現れました (図 7Db)。なお、εATPはεATP適用の反対側では認められなかった。これらの観察は、これらの観察は、デトルソールフリー膀胱調製物が充填時のメディエーターの両側経尿高滑的輸送の研究に適していることを強く示唆している。
図1:デトルッサーフリー膀胱モデルの原理(A)膀胱壁は、尿座、スグロテリウム/ラミナプロプリア(SubU/LP)、デトルソール筋肉およびセローザで構成されています。これらの各層は、尿の貯蔵および空隙の間に膀胱機能のために重要である様々な細胞タイプが含まれています。膀胱充填の間、生物学的に活性なメディエーターは、尿路から膀胱内腔に放出され、SubU/LPでは、脱石筋を含む膀胱壁の深部の細胞に影響を与える。膀胱内腔へのアクセスは比較的簡単ですが、膀胱壁の細胞に影響を与え、脱酸筋の興奮を制御する尿座由来メディエーターを検出するために、充填中にSubU/LPに直接アクセスする必要はありません。(B)脱毛筋層をセロサとともに除去すると、SubU/LPの表面全体が露出し、尿酸皮由来シグナル伝達分子を膀胱充填の異なる相で測定できるSubU/LPへの直接アクセスが可能となる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの無性およびデトルッサーのない膀胱壁のヒストロジー。マッソンのトリクロム染色は、充填されたそのまま(A)およびデトルソーフリー(B)膀胱壁は、緻密化された調製物に無傷の尿座(U)およびSubU/LPが含まれているが、デトルソー筋肉(D)およびセローザ(S)は含まれていないことを示す。L、ルーメン。この図は、前の出版物13から再現されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ex vivo膀胱製剤の充填に用いられる実験セットアップの概略表現ex vivo無傷または緻密な尿膀胱(UB)調製物は、酸素化されたクレブス重炭酸溶液(KBS、37°、pH 7.4)で浸透した暖かい(37°)水上上器官室に入れられます。膀胱調製物は、異なる充填率および体積でKBSを注入し、かつ内ルミナス膀胱圧(BP)が実験全体を通して記録されるこの図は、以前の出版物13から再現されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:無傷およびデトルッサーフリー製剤における圧力量関係(A) および(B)は、15 μL/min でクレブス重炭酸溶液で満たされたex vivoの静脈内体積および圧力の代表的な記録であり、15μL/分でクレブス重炭酸溶液で満たされています。予想にほどの無傷の調製物は、デトルッサーの存在により過渡収縮(TC)を発症した。対照的に、緻密な調製物はTC(C)および(D)を欠き、溶液の>250°Lを収容した無傷および緻密な膀胱製剤の圧力体積関係の要約データを示す。充填量および静脈内圧は、無傷および緻密な膀胱製剤において著しく類似していたことに注意してください。この図は、前の出版物13から再現されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:充填時のSubU/LPおよびルーメンにおける尿路由来メディエーターの利用可能性を評価するために利用される単離膀胱モデルの概略図。膀胱製剤は、水上ジャケットチャンバーに入れられ、酸素化されたクレブス重炭酸溶液(KBS)でスーパーフューズされます。尿膀胱(UB)製剤は、注入ポンプに接続された尿道のカテーテルを介して温かい酸素化KBSで満たされる。膀胱圧(BP)は、膀胱充填時に注入ラインを介して3ウェイコネクタを介して監視される。外ルミナル(EL、臓器浴)および内ルミナル(IL)溶液からのサンプルは、検出用途に従ってメディエーター(m)の検出のために処理されます。この図は、前の出版物13から再現されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:デトルッサーフリー膀胱調製物は、充填時のSubU/LP中のメディエーターの利用可能性を測定するのに適しています。代表的なクロマトグラムは、無傷の外ルミナルサンプル中のプリンの利用可能性を示す(A)およびデトルソールフリー(B)膀胱製剤である。プリンメディエーターは、無傷の調製物よりも緻密な調製物で検出される方が良いであることに注意してください。(C)内腔および緻密製剤のSubU/LPで検出されたプリンプールに対する個々のプリンの相対的な寄与は有意に異なる。この図は、前の出版物13から再現されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:デトルソールフリー膀胱製剤は、膀胱充填中のメディエーターの代謝および経尿器間輸送を調べるのに適している。(A,B)εATP基板を示す代表的なクロマトグラム (Aa, Ba)基板をSubU/LP(Ab)またはルーメン(Bb)εATPのいずれかに適用すると、εADP、εAMP、εADOの産物が増加した。したがって、εATP はアプリケーションの両側で劣化します。しかし、εATP産物の形成は、SubU/LPおよびルーメンにおいて非対称である。なお、εATP産物εAMP及びεADOは、基板εATPではなく、εATPアプリケーションの反対側(Ac,Bc)に現れたことに注意する。したがって、プリンは、ファイリング中にデトルッサーフリー製剤の壁を介して輸送されているように見える。この図は13から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:無傷の膀胱充填の代表的な記録。膀胱は15μL/minで満たされたビデオは、5 Hzで充電された結合デバイス(CCD)カメラを備えたズームステレオ顕微鏡を使用して記録した。記録は25mmHgの内ルミナル圧力に達すると停止した。画像の全期間は64倍のリアルタイムです。このビデオは13から再現されています。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
ビデオ2:デトルッサーフリー膀胱充填の代表的な記録。膀胱は15°L/分で満たされたビデオは、5 HzでCCDカメラを備えたズームステレオ顕微鏡を使用して記録されました。記録は25mm Hgの内ルミナル圧力に達すると停止した。画像の全期間は64倍のリアルタイムです。このビデオは13から再現されています。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
膀胱には、尿の貯蔵と空隙という2つの機能があります。これらの機能の正常な動作は、消失筋の興奮性を調節するために膀胱壁の細胞を介して信号のイントラルミナスボリュームと圧力と伝達の適切な機械的センシングを必要とします。膀胱粘膜(尿黒体)は、膀胱壁の多数の細胞型に影響を与えるSubU/LP内の様々なシグナル伝達分子を放出することによって膀胱の興奮性を調節すると考えられている。現在、尿黒糸由来メディエーターの特徴付けのほとんどの試みは、生理学的膀胱充填を再現しない膀胱製剤(例えば、平らな膀胱壁シート、膀胱壁ストリップ、または培養細胞)の使用を伴う。膀胱充填の終わりに膀胱内腔に放出されるメディエーターの測定は、尿経皮の反対側からこれらのメディエーターの放出の徴候として頻繁に使用される。しかしながら、最近の研究は、メディエーターのルミナス含有量が膀胱壁13の深部で入手可能なものの代表ではないことを示唆している。膀胱充填時にSubU/LPへのアクセスを可能にする新しい実験的アプローチは、膀胱尿黒糸、SubU/LPおよびDSM間のシグナル伝達の局所メカニズムの理解を深めるために必要である。
ここでは、充填中にSubU/LPの尿黒糸から放出されたメディエーターに直接アクセスを提供するために、デトルッサー筋肉を除去する新しい動物膀胱モデルを示す。緻密化された調製物は、無傷の膀胱13、18の充填によく似ているが、デトルッサー筋の欠如は膀胱充填中に尿経皮のメカノ感受性特性を変化しないことを示唆している。この調製は、脊髄反射および脱気筋からの伝達の混乱がない場合に膀胱に対して圧力量の研究を行うことを可能にする。従って、SubU/LPで放出されるメディエーターは他の源からの全身の影響または汚染なしで測定することができる。膀胱充填中に異なる体積および圧力でSubU/LPの近傍に直接アクセスする能力は、膀胱充填の貯蔵および空隙前段階における生物学的活性メディエーターの放出、代謝および経尿道輸送を研究するのに適したモデルを作る。
このプロトコルの最も重要なステップは、尿黒糸とSubU/LPをそのまま維持しながら、デトルッサー平滑筋の除去です。この手順は、脱石筋とSubU/LPとの間の緩い接続のために、マウス膀胱で特に簡単です。調製物は、無傷の膀胱13と著しく類似した圧力容積特性を有する優れた再現性を示した。このモデルは、脱石筋を部分的または完全に除去できる大型動物の膀胱においても実現可能である。例えば、我々は、モデルがシノモルガスサルマカカ筋膜から膀胱で再生できることを実証し、調製充填13中にSubU/LPでメディエーターを測定できることを実証した。
このex vivoモデルの潜在的な制限は、調製の強さである非常に問題であり、本質的には、中枢神経系および循環の全身的な影響の欠如は、膀胱充填中の粘膜脱トル酸接続の局所的メカニズムの徹底的な検査を可能にする。全身効果の欠如は、孤立した膀胱壁シートまたはストリップまたは培養尿中皮細胞を含む多くのex vivoアプローチと共有される。しかし、デトルッサーフリー膀胱モデルは、膀胱充填の過程でSubU/LPに直接アクセスできるという点で、泌尿器科研究における前述のアプローチよりも優れています。したがって、このアプローチを使用すると、膀胱の充填中に尿経尿器に発生するメカノ感受性メカノトランスダクション機構の理解が高まり得る。
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Disclosures
この作品の一部は、以前に生理学雑誌(PMCID:PMC6418748;DOI:10.1113/JP27692413) 。本書の資料の使用に関して、ワイリー・アンド・サンズ社から許可を得ています。著者は開示する財政的または他の矛盾を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所グラントDK41315によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
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