Summary
מודל שלפוחית השתן מאפשר גישה ישירה לסובורוטנום כדי ללמוד מנגנונים מקומיים לוויסות זמינות מגשרת פעילה ביולוגית בסווברואלינום/לאמה קינאה במהלך אחסון ובדיקת שתן. ההכנה דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן והיא מאפשרת לבצע מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו ללא השפעות מערכתיות.
Abstract
מחקרים קודמים הקימו את שחרורו של חומרים כימיים מן הסדינים שטוח רירית השלפוחית מודבקת בתאי Ussing וחשופים שינויים בלחץ הידרוסטטי או למתוח מכני ומתאי אורוטאליאל מתורבת על שינויי לחץ הידרוסטטי, למתוח, תא נפיחות, או לגרור כוחות, ובשלפוחית השתן בסוף מילוי. ממצאים כאלה הובילו את ההנחה כי מגשרים אלה שוחררו גם suburothelium (SubU)/lamina קינא (LP) במהלך מילוי שלפוחית השתן, שם הם משפיעים על התאים עמוק בקיר שלפוחית השתן כדי להסדיר בסופו של דבר את שלפוחית השתן. יש לפחות שתי מגבלות ברורות במחקרים כאלה: 1. אף אחת מגישות אלה אינה מספקת מידע ישיר על נוכחות המגשרים בסובו/LP, ו-2) הגירויים ששימשו אינם פיסיולוגיים ואינם ממלאים את השלפוחית במילוי אותנטי של שלפוחית השתן. כאן, אנו דנים הליך המאפשר גישה ישירה אל פני השטח suburothelial של רירית שלפוחית השתן במהלך מילוי שלפוחית השתן. ההכנה המבטלת-חופשית שיצרנו דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן ומאפשרת מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו על שלפוחית השתן בהעדר איתות מתוך רפלקסים מעמוד השדרה והשריר החלק. באמצעות מודל שלפוחית השתן הרומן הספר, הדגמנו לאחרונה כי מדידות הפנימי של המגשרים אינם יכולים לשמש כפרוקסי למה שוחרר או נוכח SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן. המודל מאפשר בדיקת מולקולות איתות נגזרות מסוג urothelium שפורסמו, שנוצר על-ידי חילוף החומרים ו/או מועברים לתוך SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן כדי להעביר מידע לנוירונים ושריר חלק של שלפוחית השתן ולווסת את הרגש שלה במהלך המשך ו-micturition.
Introduction
מטרת מודל זה היא לאפשר גישה ישירה לצד submucosal של רירית שלפוחית השתן במהלך שלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן.
שלפוחית השתן חייבת להימנע התכווצות מוקדמת במהלך מילוי וריק כאשר הנפח הקריטי והלחץ מגיעים. מסלול לא תקין או הרקה של שתן משויכים לעתים קרובות עם מרגש נורמלי של שריר הדטרואו חלק (DSM) במהלך מילוי שלפוחית השתן. הרגש של DSM נקבע על ידי גורמים פנימיים לתאי השריר חלקה ועל ידי השפעות שנוצרו על ידי סוגי תאים שונים בתוך הקיר שלפוחית השתן. הקיר של שלפוחית השתן מורכב מאורואלינום (רירית), סובורוטנום (SubU)/לאמינה קינאה (LP), שריר החלקה (DSM) ו serosa (איור 1A). האורוטנום מורכב מתאי מטריה (כלומר, השכבה החיצונית ביותר של האורואלינום), תאי ביניים ותאי בסיס (כלומר, השכבה הפנימית ביותר של האורואלינום). סוגים שונים של תאים, כולל תאים ביניים, תאי מסופים, מסופי עצבים כלי לימפה, כלי דם קטנים, ותאים חיסוניים שוכנים subu/LP. ההנחה היא ששלפוחית השתן היא עוגב חושי היוזם מיקרו-מתווכים של רפלקס ומוסר על ידי שחרור המגשרים לתוך רירית המשנה המשפיעים על התאים ב-subu/LP ו-DSM1,2,3. לרוב, הנחות כאלה מבוססות על מחקרים שהפגינו שחרור מגשרים: מפיסות רירית חשופים לשינויים בלחץ ההידרוסטטי4,5; מתוך מגוון התאים המתורבתות חשופים למתיחה6,7, היפוטונזה המושרה תא נפיחות7 או לגרור כוחות8; מתוך שלפוחית בודדה רצועות קיר על הקולטן או הפעלה עצביים9,10,11,12,13,14; ובשלפוחית השתן לומן בסוף שלפוחית השתן מילוי15,16,17,18,19. בעוד שמחקרים כאלה היו אינסטרומנטלי להפגין שחרור של מגשרים על גירוי מכני של מקטעי קיר שלפוחית השתן או תאים מתורבתים של אורוטאליאל, הם צריכים להיות נתמכים על ידי ראיות ישירות לשחרור של מגשרים ברירית המשנה כי הוא הרוויח על ידי גירויים פיסיולוגיים לשכפל מילוי שלפוחית השתן. זוהי משימה מאתגרת בהתחשב בעובדה SubU/LP ממוקם עמוק בתוך הקיר שלפוחית השתן מכניסה את הגישה הישירה לקרבת SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן.
כאן, אנו להמחיש מבוזר (ex vivo) מודל שלפוחית השתן murine עם שריר השריר הוסר13 אשר פותחה כדי להקל על מנגנונים מקומיים של המנגנון המנגנון השתתפות האיתות בין שלפוחית השתן urothelium, DSM וסוגי תאים אחרים בקיר שלפוחית השתן. גישה זו היא מעולה לשימוש סדינים שטוח הקיר, רצועות הקיר שלפוחית השתן או התאים התרבותיים אורוטאליאל משום שהוא מאפשר מדידות ישירה בקרבת SubU/LP של urothelial המגשרים, כי הם שוחרר או הוקמה בתגובה ללחצים פיזיולוגיים וכלי שלפוחית השתן וימנע השינויים הפוטנציאליים בתרבות התא ניתן להשתמש בו כדי למדוד זמינות, שחרור, חילוף החומרים והעברת התחבורה של המגשרים SubU/LP בשלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן (איור 1B). ההכנה יכולה לשמש גם כדי לבחון את האיתות האורואליאל והמכונה במודלים של תסמונות שלפוחית השתן הפרוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים המתוארים בכתב יד זה נערכו על פי מכון הבריאות הלאומי לטיפול והשימוש בבעלי חיים מעבדתיים והשימוש בבעלי חיים מוסדיים וועדת הטיפול באוניברסיטת נבאדה.
הערה: הדגם המוצג כאן מורכב מהסרת השריר הדטראאו בעוד שהאורוטאום וסובו/LP מנותרים ללא פגע (איור 1ב) כדי לאפשר לחוקרים גישה ישירה אל subu/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן.
1. הכנת הדטראאור-הכנה לשלפוחית השתן ללא תשלום
- מניחים את שלפוחית השתן המבודדת בצלוחית מחולקת עם קור (10 ° c) ו חמצן עם 5% CO2/95% O2 קרבס ביקרבונט פתרון (kbs) עם ההרכב הבא (mM): 118.5, 4.2 Kbs, 1.2 mgcl2, 23.8 נחקו3, 1.2 KH2PO4, 11.0 דקסטרוז, 1.8 cacl2 (pH 7.4)13.
- להצמיד חלק קטן של הכיפה של שלפוחית השתן המבודד כדי מכסה מכוסה Sylgard ממולא KBS. ודא כי הסיכה עוברת דרך פיסת serosa או הקצה החיצוני של השריר העמוק הרחק מן הקצה הפנימי של השריר הפונה אל SubU/LP.
- באמצעות מיקרוסקופ, לזהות את השופכה ואת ureters ולהצמיד כל אחד מהם לתחתית הצלחת לבתר.
- הסירו את עודפי האדיפוז ורקמות החיבור כך שכל הגוף העיקרי של שלפוחית השתן, השופכה ושני השופכה יוצגו.
- לקשור את הureters עם 6-0 תפרים ניילון. לאחר מכן, הצמד את הקצוות הפתוחים של השופכה לעבר החלק התחתון של הצלחת הבתר כדי לאבטח את התכשיר.
- בעזרת מלקחיים דקים, משוך בעדינות את החלק של serosa בפינה בין השופכה לבין גוף שלפוחית השתן.
- התאימו את האור של המיקרוסקופ כדי להגדיל את השקיפות ולהבדיל בין משולי רירית המשנה שמתחת לשריר הדטראאו.
- התחל לחתוך (לא לקילוף!) קיר שלפוחית השתן עם מספריים עצה משובחת לאורך המשטח הפנימי של שכבת השריר הדטרואו תוך כדי בעדינות למשוך את קטע החיתוך הרחק מן ההכנה. בכל עת, לוודא את הקצה לרוחב של רירית ניתן לראות ולהימנע מלגעת בו.
- הסר את השריר הדטראאו לחלוטין על-ידי הפעלת המנה המחרטה כך שמיקום ההכנה יהיה נוח להמשיך לבתר את השריר החוצה.
- השאירו חתיכה קטנה של שריר הדטרואו על החלק העליון של כיפת שלפוחית השתן כדי להבטיח את היכולת לשתק את ההכנה במהלך השלבים הנותרים של הפרוטוקול.
- לעשות לולאה כפולה של 6-0 ניילון חוט, למקם אותו סביב הצוואר של הכנת שלפוחית השתן, ולהשאיר את הלולאה רופף.
- להוסיף לולאה כפולה השני של 6-0 חוט משי, למקם אותו סביב הצוואר של הכנת שלפוחית השתן, ולהשאיר את הלולאה להפסיד. שני תפרים מונעים. דליפות מסביב לתפרים
- חותכים כ 2 ס מ של 20 הצינורות PE (קטטר), להתלקח את הקצה על ידי הזזת לאט את הקצה קרוב ללהבה.
- ממלאים את הצנתר בחום (37 ° c) מחמצן.
- הכנס את הצנתר בתוך הפתח של השופכה שלפוחית השתן ובעדינות לדחוף את הקטטר עד קצה הקטטר מגיע בערך באמצע שלפוחית השתן.
- לקשור את התפר סביב הקטטר ואת הרקמה המקיפה של צוואר שלפוחית השתן.
- באיטיות למלא את שלפוחית השתן עם כ 50-100 μL של חם (37 ° c) חמצון KBS, להרים אותו בקצרה (< 10 s) מעל פני השטח של KBS, ולפקח על דליפות בגוף התפרים ושלפוחית השתן.
- אם לא נצפתה דליפה, ההכנה היא מוכנה לניסוי. אם הדליפה סביב התפר הוא נצפתה, להסיר את התפר ולהחליף אותו. אם הדליפה מתוך חור בגוף שלפוחית השתן הוא הבחין, להיפטר ההכנה.
2. מילוי הכנת שלפוחית השתן הדנית
- מבשם KBS (37 ° c) לחדר של 3 מ ל של מים (37 ° c) כיסה כלי עוגב עם תחתית סילגארד.
- . התאימו את קווי החמצן והיניקה
- מניחים את ההכנות. לשלפוחית השתן בחדר
- אבטחו את הקטטר לצד החדר כך שההכנה לא תצוף מעל פני השטח של פתרון הפרפיוז.
- לחבר את הקטטר שלפוחית השתן PE20 אבובים יותר (קו העירוי) מחובר שלוש הדרך רזלים תרנגול באמצעות התאמת גודל זהה.
- ודא כי הקווים בין משאבת העירוי, מתמר הלחץ ושלפוחית השתן פתוחים.
- ממלאים את מזרק האינפוזיה בחום, חם וחמים (37 ° c) וכיריים מחמצן.
- להתאים את הפרמטרים המשאבה: סוג/נפח של מזרק (כלומר, 1 מ ל), הפעלה (כלומר להשרות), זרימה (כלומר, קבוע), ואת קצב הזרימה (כלומר, 15 μL/min).
- לחץ על לחצן התחל על משאבת המזרק כדי למלא את שלפוחית השתן.
- ניטור נפח המילוי והלחץ הפנימי במהלך מילוי שלפוחית השתן.
3. זיהוי מגשרים בהיבט של הכנת שלפוחית השתן הדנית
- לאסוף המרכיטים של פתרון האמבטיה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה קר-קרח או כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (בדיקות) מוסיף.
- הכן ועבד את הדגימות בהתאם ליישום הזיהוי המתאים. במקרה של זיהוי זמינות של פורין, עבד את הדגימות על-ידי בדיקות באמצעות זיהוי של קרינה פלואורסצנטית13,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קיר של הכנת שלפוחית השתן מורטין ללא פגע והוא מכיל את כל השכבות מלבד DSM ו serosa. לימודי הוכחת העיקרון הוכיחו שחומת השלפוחית החופשית של ה-DSM כוללת את האורואלינום וסובו/LP, בעוד שבטונאיקה מוסקולריס והסראוסה נעדרים (איור 2)13.
מילוי שלפוחית השתן הדטראלית. ממלאת את שלפוחית השתן הרגילה איור 3 מציג תרשימים של ההתקנה הניסיונית למילוי ההכנות vivo שלפוחית השתן לשעבר בשיעורי מילוי שונים, כרכים ולחצים intraluminal. ההכנות הvivo לשעבר מורלין והכנות שלפוחית השתן דורשות מגוון רחב של אמצעי אחסון מילוי כדי להגיע ללחץ על התריסריון13. מערכות היחסים בנפח הלחץ דומות במידה ניכרת בהכנות שלמות ומיושנות (סרט 1, סרט 2 ואיור 4). לפיכך, ההכנה ללא DSM מתאימה למחקרים פונקציונליים של התפקיד של אורוטיום ו SubU/LP בתוך מכנימת שלפוחית השתן ומכניקציה.
שימוש אפשרי במודל שלפוחית השתן ללא תשלום
מדידת זמינות של מגשרים בשלפוחית השתן לומן SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן
ההתקנה הניסיונית לאיסוף חיצוניים (אל; למשל, רחצה SubU/LP) ו intraluminal (IL) דגימות במהלך מילוי ההכנות שלפוחית השתן בעת ניטור לחץ שלפוחית השתן מומחש באיור 5. התאמת המודל למדידת המגשרים הנגזרים שפורסמו בצידו הסובו/LP במהלך המילוי נבדק על ידי מדידת שחרורו של מגשרים מסוג פורין (למשל, אדנוזין 5 '-triphosphate, ATP; אדנוזין 5 '-diphosphate, ADP; מmonophosphate-אדנוזין, מגבר; ו-אדנוזין, ADO) בפתרון רחצה subu/LP של ההכנה הנסבעת למטה. כפי שמתואר באיור 6A, הכמויות זניח של הפורנים זוהו באמבט המכיל הכנה לשלפוחית השתן מבודדת עם DSM שלם בעוד הכמויות של הפורנים האלה היו גבוהים באופן משמעותי בדגימות שנאספו מהאמבטיה המכיל הכנה לשלפוחית השתן (איור 6ב). בעיקר, התפלגות הפורבנים ומטבוליטים בדגימות שנאספו מן הלוומן ו SubU/LP בסוף המילוי שונה באופן משמעותי (איור 6ג).
בחינת חילוף החומרים של המגשרים SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן
בנוסף לאנלוגי מאוד-פלורסנט של ATP, 1,N6-etheno-ATP (εATP), לצידו הסובורוטאלי של ההכנה לביטול הדטרואו ללא תשלום, הביא לירידה של εATP ולעלייה במוצרי εATP ΕADP, ΕAMP וεADO (איור 7Aa ואיור 7Ab). כמו כן, תוספת של εATP לומן הכנה הביא ירידה של εATP ועלייה ב εADP, εAMP, ו εADO ב לומן (איור 7Ba ואיור 7Bb). לכן, המודל מתאים ללימודי חילוף חומרים של מתווכים ביו-אקטיביים משני צידי האורוטיום במהלך מילוי שלפוחית השתן.
בחינת הובלת מגשרים במהלך מילוי שלפוחית השתן
תוספת של εATP של subu/LP של ההכנה צטיירת הביא את המראה של εAMP, εADO וכמה εADP ב לומן, הטוען כי ניתן להעביר את הפורנים מ subu/lp אל לומן13 (איור 7Ac). כמו כן, הוספת εATP ב לומן הביא את המראה של εAMP ו εADO ב SubU/LP13 (איור 7Db). שים לב כי εATP לא נצפתה בצד הנגדי של האפליקציה εATP. ביחד, תצפיות אלה מרמזות בתוקף כי ההכנה לשלפוחית השתן החופשית מתאימה למחקרים של הובלת המגשרים הדו במהלך המילוי.
איור 1: עקרון המודל לשלפוחית השתן. (א) קיר שלפוחית השתן מורכב אורוטאלינום, סובורוטאום/לאמינה קינא (SubU/LP), שריר השרירים וסראסה. כל אחת מהשכבות הללו מכילה סוגי תאים שונים החשובים לפונקציות של שלפוחית השתן במהלך אחסון ושתן של שתן. במהלך מילוי שלפוחית השתן, מגשרים פעילים ביולוגית שוחררו מן urothelium לתוך לומן שלפוחית השתן ו SubU/LP להשפיע על התאים עמוק בקיר שלפוחית השתן, כולל שריר הזרע או השריר. בעוד הגישה לומן שלפוחית השתן היא פשוטה יחסית, אין גישה ישירה SubU/LP במהלך מילוי כדי לזהות urothelium נגזר המגשרים שעשויים להשפיע על התאים בקיר שלפוחית השתן ושליטה השפעה השריר או הרגש. (ב) הסרת שכבות השריר והשרירים יחד עם serosa חושף את פני השטח כולו של SUBU/lp המאפשר גישה ישירה אל subu/lp שבו urothelium-מולקולות איתות נגזר ניתן למדוד בשלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: היסטולוגיה של קירות שלפוחית השתן מורנה ללא פגע ונטול. הצבע התלת-כרום של מאסנה של קירות שלפוחית השתן ממולא (א) והדטרואו-נטול (B) ממחיש כי ההכנה הנספית מכילה אורוטאלינום שלם (U) ו-subu/LP, אך לא את השריר (D) ו-serosa (s). . אני, לומן איור זה שוחזר מפרסום קודם של13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצוג סכמטי של ההתקנה הניסיונית המשמש מילוי ההכנות לשעבר שלפוחית השתן vivo. הכנה לשעבר vivo שלפוחית השתן או המרה (ובלבד) ההכנה ממוקם חם (37 ° c) בחדר העוגב כיסה הגוף כי הוא מעשה עם הפתרון Krebs-ביקרבונט (KBS, 37 ° c, pH 7.4). הכנת שלפוחית השתן היא מקורה עם KBS בשיעורי מילוי שונים, אמצעי אחסון שלפוחית השתן intraluminal (BP) נרשם במהלך הניסוי איור זה הועתק מהפרסום הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מערכות יחסים בנפח הלחץ בהכנות ללא שינוי ובלא-חופשיות. (א) ו (ב) הם הקלטות הנציג של נפח והלחץ הפנימי של הvivo לשעבר וההכנות שלפוחית השתן צטיירת, כי הם מלאים בפתרון krebs-ביקרבונט ב 15 μl/min. כפי שציפינו, ההכנה ללא שינוי פיתחה התכווצויות זמניות (TCs) בשל נוכחותם של הדטרואו. לעומת זאת, ההכנה המאובמת לא היתה TCs. (ג) ו-(ד) להראות נתונים מסוכמים של יחסי לחץ בהיקף של ההכנות שלמות ושלפוחית השתן אשר שוכנו > 250 μl של פתרון. שימו לב כי מילוי אמצעי האחסון והלחצים התוך-פיזיים היו דומים במידה ניכרת להכנות לשלפוחית השתן וללא שלמות. איור זה שוחזר מפרסום קודם של13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תרשים סכמטי של מודל שלפוחית השתן המבודד מנוצל כדי להעריך את הזמינות של המגשרים הנגזרים הנגזרות SubU/LP ולומן במהלך מילוי. הכנת שלפוחית השתן ממוקם בחדר כיסה המים התמזגו עם הפתרון ביקרבונט החמצן Krebs (KBS). שלפוחית השתן (והכנה) מלאה KBS החמצן חם דרך קטטר בשופכה מחובר משאבת אינפוזיה. לחץ שלפוחית השתן (BP) מפוקח באמצעות מחבר שלושה כיוון דרך קו העירוי במהלך מילוי שלפוחית השתן. דוגמאות ממקורות חיצוניים (אל, עוגב) ופתרונות intraluminal (IL) מעובדים לאיתור מגשרים (m) על פי יישומי האיתור. איור זה שוחזר מפרסום קודם של13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ההכנה לשלפוחית השתן מתאימה למדידת הזמינות של המגשרים SubU/LP במהלך המילוי. הנציגה כרומאטוגרם להפגין את הזמינות של הפורנים בדגימות החיצוניים (א) והתרופות ללא שלפוחית השתן (ב). שימו לב כי המגשרים הפודין מזוהים טוב יותר בהכנה הכנה מאשר בהכנה השלמה. (ג) התרומה היחסית של הפורינות הבודדות לבריכות הפורצין שאותרו בלוומן ובסובו/LP של ההכנה הנספית, שונה באופן משמעותי. איור זה שוחזר מפרסום קודם של13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ההכנה לשלפוחית השתן החופשית מתאימה לבדיקת חילוף חומרים והובלת מגשרים במהלך מילוי שלפוחית השתן. (א, ב) הנציגה chromatograms מראה εATP מצע (Aa, Ba). כאשר המצע מוחל על SubU/LP (Ab) או לומן (Bb) εATP הופחת ואת המוצרים εADP, εAMP, ו εADO גדלו. לכן, εATP מושפל בכל צד של האפליקציה; עם זאת, היווצרות של מוצרי εATP הוא סימטרי ב SubU/LP ו לומן. שים לב כי מוצרי εATP εAMP ו εADO, אבל לא המצע εATP, הופיע בצד השני של יישום εATP (Ac, Bc). לכן, נראה שהפורנים מועברים דרך הקיר של ההכנה הדטראאין והחופשית במהלך התיוק. דמות זו שונתה מ-13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הקלטה ייצוגית של מילוי שלפוחית השתן ללא שינוי. שלפוחית השתן היה מתמלא 15 μL/min. Video נרשמה באמצעות מstereomicroscope זום עם מצלמה טעונה מצמידים (CCD) ב 5 הרץ; ההקלטה נעצרה. והגיעה ל -25 מהלחצים האינטרולוקל משך מלא של התמונה הוא 64x בזמן אמת. וידאו זה שוחזר מ-13. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
וידאו 2: הקלטה ייצוגית של מילוי שלפוחית השתן בחינם. שלפוחית השתן מילא 15 μl/min. וידאו נרשם באמצעות stereomicroscope זום עם מצלמת CCD ב 5 הרץ; ההקלטה נעצרה עם הגעה ללחץ של 25 מ"מ כספית. המשך המלא של התמונה הוא 64 פעמים בזמן אמת. וידאו זה שוחזר מ-13. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלפוחית השתן יש שתי פונקציות: אחסון ו-ווצמה של שתן. הפעולה הרגילה של פונקציות אלה דורש חישה מכנית נאותה של נפח intraluminal והלחץ והתמרה של אותות דרך תאים בקיר שלפוחית השתן כדי לווסת את השרירים שרירים או מרגש. רירית שלפוחית השתן (אורוטאלינום) הוא האמין לווסת את הרגש שלפוחית השתן על ידי שחרור מגוון של מולקולות איתות ב SubU/LP המשפיעים על סוגי תאים רבים בקיר שלפוחית השתן. כיום, רוב הנסיונות באפיון המגשרים הנגזרים מעורבים בשימוש בהכנות לשלפוחית השתן (לדוגמה, יריעות קיר שטוחות, רצועות קיר שלפוחית השתן, או תאים מתורבתים) שאינם מתרבים מילוי שלפוחית השתן הפיסיולוגית. מדידות של מגשרים שפורסמו לומן שלפוחית השתן בסוף מילוי שלפוחית השתן משמשים לעתים קרובות כאינדיקציה לשחרור של מגשרים אלה מהצד הנגדי של האורוטיום. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תוכן intraluminal של מגשרים אינו נציג של מה זמין עמוק בקיר שלפוחית השתן13. גישות נסיוניות הרומן המאפשרות גישה SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן נחוצים כדי להרחיב את הבנתנו של מנגנונים מקומיים של איתות בין שלפוחית השתן urothelium, SubU/LP ו-DSM.
כאן אנו מדגימים מודל של שלפוחית השתן הרומן שבו השריר מוסר כדי לספק גישה ישירה למגשרים שפורסמו מתוך האורוטנום ב SubU/LP במהלך מילוי13. ההכנה מקרוב דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן בשלמותה13,18, הרומז כי חוסר השריר או שריר לא משנה את התכונות המכלאולית של uרות'אלינום במהלך מילוי שלפוחית השתן. ההכנה מאפשרת לחץ-מחקרים להתבצע על שלפוחית השתן בהעדר איתות מייסד מן הרפלקסים השדרה ואת השריר. לפיכך, ניתן למדוד מגשרים שפורסמו בסובו/LP ללא השפעות מערכתיות או זיהום ממקורות אחרים. היכולת לגשת ישירות לאזור SubU/LP בכרכים ולחצים שונים במהלך מילוי שלפוחית השתן הופך את המודל למתאים לשחרור הלמידה, לחילוף החומרים ולהעברת התחבורה של המגשרים הפעילים ביולוגית במהלך האחסון ובשלבים טרום-המעבר של מילוי שלפוחית השתן.
הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הסרת השריר העדין או החלקלק תוך שמירה על האורואלינום והסובו/LP שלמים. ההליך הוא פשוט במיוחד בשלפוחית השתן של העכבר בשל הקשר רופף בין השריר הדטרואו SubU/LP. ההכנות הראו שינוי מצוין מאוד עם מאפיינים דומים במיוחד ללחץ בלחיצה על שלפוחיות שתן שלמות13. המודל ניתן גם להשלפוחיות מבעלי חיים גדולים, בהם השריר הדטראאו יכול להיות מסולק חלקית או לחלוטין. לדוגמה, הדגמנו בעבר כי המודל יכול להיות מועתק בשלפוחית השתן של הקוף Cynomolgus מאצ , והפגינו כי ניתן למדוד את המגשרים ב subu/LP במהלך מילוי ההכנה13.
המגבלה הפוטנציאלית של מודל זה לשעבר vivo הוא בעיה מאוד כי הוא הכוח של ההכנה, במהותו, חוסר השפעות מערכתיות של מערכת העצבים המרכזית וזרימת התנועה מאפשר בדיקה יסודית של מנגנונים מקומיים של רירית-מקור או קישוריות במהלך מילוי שלפוחית השתן . העדר תופעות מערכתיות משותפות עם גישות רבות לשעבר vivo, כולל שלפוחית השתן מבודדים גיליונות או רצועות או תאי urothelial תרבותי. אולם, מודל שלפוחית השתן החופשית, לעומת זאת, עולה על הגישות האמורות במחקר באורוטאליאל בכך שהיא מאפשרת גישה ישירה ל-SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן. לכן, השימוש בגישה זו ישפר את ההבנה של מנגנוני המנגנון המכאניים הרגישים שמקורם באורוטיום בזמן מילוי שלפוחית השתן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
חלקים מעבודה זו פורסמו בעבר בכתב העת לפיזיולוגיה (PMCID: PMC6418748; דוי: 10.1113/JP27692413). הרשות ניתנה על ידי ויילי ובניו, Inc. לשימוש בחומרים מפרסום זה. למחברים אין התנגשויות פיננסיות או אחרות לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות גרנט DK41315.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A.
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
