Un modelo de vejiga murina descentralizada (Ex Vivo) con el músculo detrusor eliminado para el acceso directo al suburotelio durante el llenado de la vejiga
Summary
El modelo de vejiga libre de detrusores permite el acceso directo al suburotelio para estudiar los mecanismos locales para la regulación de la disponibilidad de mediadores biológicamente activos en suburothelium/lamina propria durante el almacenamiento y la anulación de la orina. La preparación se asemeja mucho al llenado de una vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión sin influencias sistémicas.
Abstract
Estudios anteriores han establecido la liberación de sustancias químicas de las láminas de la mucosa de la vejiga plana colocadas en las cámaras ussing y expuestas a cambios en la presión hidrostática o el estiramiento mecánico y de las células uroteliales cultivadas tras cambios de presión hidrostática, estiramiento, hinchazón celular o fuerzas de arrastre, y en lumen vesical al final del llenado. Tales hallazgos llevaron a la suposición de que estos mediadores también se liberan en suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) durante el llenado de la vejiga, donde afectan a las células profundas de la pared de la vejiga para regular en última instancia la excitabilidad de la vejiga. Hay al menos dos limitaciones obvias en tales estudios: 1) ninguno de estos enfoques proporciona información directa sobre la presencia de mediadores en SubU/LP, y 2) los estímulos utilizados no son fisiológicos y no recapitulan el llenado auténtico de la vejiga. Aquí, discutimos un procedimiento que permite el acceso directo a la superficie suburotelial de la mucosa de la vejiga en el curso del llenado de la vejiga. La preparación libre de detrusores murinos que creamos se asemeja mucho al llenado de la vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión en la vejiga en ausencia de señalización de confunción a partir de reflejos espinales y músculo liso detrusor. Utilizando el nuevo modelo de vejiga libre de detrusores, recientemente demostramos que las mediciones intravesicales de los mediadores no se pueden utilizar como un proxy de lo que se ha liberado o está presente en la SubU/LP durante el llenado de la vejiga. El modelo permite el examen de moléculas de señalización derivadas del urotelio que se liberan, generadas por el metabolismo y/o transportadas a la SubU/LP durante el transcurso del llenado de la vejiga para transmitir información a las neuronas y el músculo liso de la vejiga y regular su excitabilidad durante la continencia y la micción.
Introduction
El propósito de este modelo es permitir el acceso directo al lado submucoso de la mucosa de la vejiga durante diferentes fases de llenado de la vejiga.
La vejiga debe abstenerse de contracción prematura durante el llenado y vaciarse cuando se alcanza el volumen crítico y la presión. La continencia anormal o el vaciado de orina se asocian con frecuencia con excitabilidad anormal del músculo liso del detrusor (DSM) en el curso del llenado de la vejiga. La excitabilidad de DSM está determinada por factores intrínsecos a las células musculares lisas y por influencias generadas por diferentes tipos de células dentro de la pared de la vejiga. La pared de la vejiga urinaria consiste en urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo liso detrusor (DSM) y serosa(Figura 1A). El urotelio consiste en células paraguas (es decir, la capa más externa del urotelio), células intermedias y células basales (es decir, la capa más interna del urotelio). Varios tipos de células, incluyendo células intersticiales, fibroblastos, terminales nerviosos aferentes, vasos sanguíneos pequeños y células inmunitarias residen en el SubU/LP. Se asume ampliamente que el urotelio vesical es un órgano sensorial que inicia la micción y la continencia reflejoliberando mediadores en la submucosa que afectan a las células de la SubU/LP y al DSM1,2,3. En su mayor parte, tales suposiciones se basan en estudios que han demostrado la liberación de mediadores: de piezas de mucosa expuestas a cambios en la presión hidrostática4,5; de células uroteliales cultivadas expuestas al estiramiento6,7, hinchazón celular inducida por hipotonía7 o fuerzas de arrastre8; de tiras aisladas de la pared de la vejiga tras la activación del receptor o del nervio9,10,11,12,13,14; y en el lumen de la vejiga al final del llenado de la vejiga15,16,17,18,19. Si bien estos estudios fueron fundamentales para demostrar la liberación de mediadores sobre la estimulación mecánica de segmentos de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas, deben estar respaldados por evidencia directa para la liberación de mediadores en la submucosa que se provoca por estímulos fisiológicos que reproducen el llenado de la vejiga. Esta es una tarea difícil dado que el SubU/LP se encuentra en lo profundo de la pared de la vejiga, lo que dificulta el acceso directo a las proximidades de SubU/LP durante el llenado de la vejiga.
Aquí, ilustramos un modelo de vejiga murina descentralizado (ex vivo) con el músculo detrusor extirpado13 que fue desarrollado para facilitar estudios sobre los mecanismos locales de mecanotransducción que participan en la señalización entre el urotelio de la vejiga, DSM y otros tipos de células en la pared de la vejiga. Este enfoque es superior al uso de láminas planas de la pared de la vejiga, tiras de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas porque permite mediciones directas en las proximidades de SubU/LP de mediadores derivados del urotelio que se liberan o se forman en respuesta a presiones fisiológicas y volúmenes en la vejiga y evita posibles cambios fenotípicos en el cultivo celular. Se puede utilizar para medir la disponibilidad, liberación, metabolismo y transporte transurotelial de mediadores en SubU/LP en diferentes etapas de llenado de la vejiga(Figura 1B). La preparación también se puede utilizar para examinar la señalización urotelial y la mecanotransducción en modelos de síndromes de vejiga hiperactivos y hipoactivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vejiga tiene dos funciones: almacenamiento y vaciado de orina. El funcionamiento normal de estas funciones requiere una correcta sensibilidad mecánica del volumen intraluminal y la presión y la transducción de las señales a través de las células en la pared de la vejiga para regular la excitabilidad muscular detrusor. Se cree que la mucosa de la vejiga (urothelium) regula la excitabilidad de la vejiga liberando una variedad de moléculas de señalización en el SubU/LP que afectan a numerosos tipos de células e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Beca dk41315 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
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