Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica
Summary
Il modello di vescica privo di detrusivi consente l’accesso diretto al suburothelium per studiare i meccanismi locali per la regolazione della disponibilità del mediatore biologicamente attivo in suburothelium/lamina propria durante lo stoccaggio e lo svuotamento delle urine. La preparazione assomiglia da vicino al riempimento di una vescica intatta e consente di eseguire studi sul volume di pressione senza influenze sistemiche.
Abstract
Studi precedenti hanno stabilito il rilascio di sostanze chimiche da fogli di mucosa della vescica piatta apposti nelle camere di ussing ed esposti a cambiamenti nella pressione idrostatica o tratto meccanico e dalle cellule umaleali coltivate su cambiamenti di pressione idrostatica, stretch, gonfiore cellulare, o forze di trascinamento, e in lucentezza della vescica alla fine del riempimento. Tali risultati hanno portato all’ipotesi che questi mediatori siano rilasciati anche in suburolio (SubU)/lamina propria (LP) durante il riempimento della vescica, dove influenzano le cellule profonde nella parete della vescica per regolare in ultima analisi l’escitabilità della vescica. Ci sono almeno due ovvie limitazioni in tali studi: 1) nessuno di questi approcci forniscono informazioni dirette sulla presenza di mediatori in SubU/LP, e 2) gli stimoli utilizzati non sono fisiologici e non riassumono l’autentico riempimento della vescica. Qui, discutiamo una procedura che consente l’accesso diretto alla superficie suburoteliale della mucosa della vescica nel corso del riempimento della vescica. La preparazione senza detrusioni murine che abbiamo creato assomiglia molto al riempimento della vescica intatta e consente di eseguire studi di volume di pressione sulla vescica in assenza di segnalazione confusa da riflessi spinali e muscolo liscio detrusore. Utilizzando il nuovo modello di vescica priva di detrustori, abbiamo recentemente dimostrato che le misurazioni intrassiche dei mediatori non possono essere utilizzate come proxy per ciò che è stato rilasciato o presente nel SubU/LP durante il riempimento della vescica. Il modello consente l’esame delle molecole di segnalazione derivate dall’urotelium che vengono rilasciate, generate dal metabolismo e/o trasportate nel SubU/LP durante il corso del riempimento della vescica per trasmettere informazioni ai neuroni e al muscolo liscio della vescica e regolarne l’eccitabilità durante la continenza e la miturismo.
Introduction
Lo scopo di questo modello è quello di consentire l’accesso diretto al lato submucosale della mucosa della vescica durante le diverse fasi di riempimento della vescica.
La vescica deve astenersi da una contrazione prematura durante il riempimento e vuota quando si raggiunge il volume critico e la pressione. Continenza anormale o svuotamento delle urine sono spesso associati con eccitabilità anormale del muscolo detrusore liscio (DSM) nel corso del riempimento della vescica. L’eccitabilità del DSM è determinata da fattori intrinseci alle cellule muscolari lisce e da influenze generate da diversi tipi di cellule all’interno della parete della vescica. La parete della vescica urinaria è costituita da urotelium (mucosa), suburotilio (SubU)/lamina propriale (LP), muscolo detrustore liscio (DSM) e sirosa (Figura 1A). L’urotelium è costituito da cellule ombrelli (cioè lo strato più esterno dell’urolium), cellule intermedie e cellule basali (cioè lo strato più interno dell’urothelium). Vari tipi di cellule, tra cui cellule interstitial, fibroblasti, terminali nervosi afferenti, piccoli vasi sanguigni, e le cellule immunitarie risiedono nella SubU/ LP. È ampiamente ipotizzato che l’urotelium della vescica sia un organo sensoriale che avvia la minzione riflessiva e la continenza rilasciando mediatori nella submucosa che colpiscono le cellule nel SubU/ LP e nel DSM1,2,3. Per la maggior parte, tali ipotesi si basano su studi che hanno dimostrato il rilascio di mediatori: da pezzi di mucosa esposti a cambiamenti di pressione idrostatica4,5; da cellule uoreliali coltivate esposte al tratto6,7, cella indotta dall’ipotonicitàgonfiore 7 o forze di trascinamento8; da strisce di parete della vescica isolate alrecettoreo attivazione del nervo9,10,11,12,13,14; e nel lume della vescica alla fine della vescica che riempie15,16,17,18,19. Mentre tali studi sono stati strumentali per dimostrare il rilascio di mediatori sulla stimolazione meccanica di segmenti della parete della vescica o cellule urotelia coltivate, hanno bisogno di essere supportati da prove dirette per il rilascio di mediatori nella submucosa che è suscitata da stimoli fisiologici che riproducono il riempimento della vescica. Questo è un compito impegnativo dato che il SubU / LP si trova in profondità nella parete della vescica ostacolando il semplice accesso alle vicinanze di SubU / LP durante il riempimento della vescica.
Qui, illustriamo un modello di vescica murina decentralizzata (ex vivo) con il muscolo detrusor rimosso13 che è stato sviluppato per facilitare gli studi sui meccanismi locali di meccanotransduzione che partecipano alla segnalazione tra l’urothelium della vescica, DSM e altri tipi di cellule nella parete della vescica. Questo approccio è superiore all’utilizzo di fogli piatti della parete della vescica, strisce di parete della vescica o cellule uroliali coltivate perché consente misurazioni dirette in prossimità di SubU/LP di mediatori derivati dall’urothelium che vengono rilasciati o formati in risposta a pressioni fisiologiche e volumi nella vescica ed evita potenziali cambiamenti fenotipici nella coltura cellulare. Può essere utilizzato per misurare la disponibilità, il rilascio, il metabolismo e il trasporto transuroteliale dei mediatori in SubU/LP in diverse fasi di riempimento della vescica (Figura 1B). La preparazione può essere utilizzata anche per esaminare la segnalazione uoteliale e la meccanotrazione in modelli di sindromi della vescica iperattiva e sottoattiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vescica ha due funzioni: stoccaggio e svuotamento dell’urina. Il normale funzionamento di queste funzioni richiede un adeguato rilevamento meccanico del volume e della pressione intraluminale e la trasduzione dei segnali attraverso le cellule nella parete della vescica per regolare l’eccitabilità muscolare detrusatrice. La mucosa della vescica (urothelium) è creduta per regolare l’eccitabilità della vescica rilasciando una varietà di molecole di segnalazione nella SubU/LP che colpiscono numerosi tipi di cellule ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’Istituto Nazionale di Diabete e Malattie Digestive e Neovirali DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
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