Een gedecentraliseerd (ex vivo) Murine blaas model met de detrusor spier verwijderd voor directe toegang tot het Suburothelium tijdens blaas vulling
Summary
Het detrusor vrije blaas model maakt directe toegang tot het suburothelium mogelijk om lokale mechanismen te bestuderen voor regulatie van biologisch actieve mediator beschikbaarheid in suburothelium/lamina propria tijdens opslag en het vernietigen van urine. Het preparaat lijkt sterk op het vullen van een intacte blaas en maakt het mogelijk om druk volume studies te verrichten zonder systemische invloeden.
Abstract
Eerdere studies hebben het vrijkomen van chemische stoffen uit platte blaas slijmvlies bladen vastgesteld in Ussing kamers en blootgesteld aan veranderingen in hydrostatische druk of mechanisch stretch en uit gekweekte oerotheliale cellen bij hydrostatische drukveranderingen, Stretch, celzwelling, of sleep krachten, en in blaas lumen aan het einde van het vullen. Dergelijke bevindingen leidden tot de veronderstelling dat deze bemiddel kers ook vrijkomen in suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) tijdens blaas vulling, waar ze de cellen diep in de blaaswand beïnvloeden om uiteindelijk de prikkelbaarheid van de blaas te reguleren. Er zijn ten minste twee duidelijke beperkingen in dergelijke studies: 1) geen van deze benaderingen bieden directe informatie over de aanwezigheid van mediatoren in SubU/LP, en 2) de gebruikte stimuli zijn niet fysiologisch en niet recapituleren authentieke vulling van de blaas. Hier bespreken we een procedure die directe toegang tot het suburotheliale oppervlak van het blaas slijmvlies in het verloop van de blaas vulling mogelijk maakt. De Murine detrusor-vrije bereiding die we hebben gemaakt, lijkt sterk op het vullen van de intacte blaas en maakt het mogelijk om druk volume studies op de blaas uit te voeren bij afwezigheid van verstorende signalering uit spinale reflexen en detrusor gladde spieren. Met behulp van het Roman detrusor-Free blaas model hebben we onlangs aangetoond dat intravesicale metingen van mediatoren niet kunnen worden gebruikt als een proxy voor wat is vrijgegeven of aanwezig in de SubU/LP tijdens blaas vulling. Het model maakt onderzoek mogelijk van urothelium-afgeleide signaal moleculen die vrijkomen, gegenereerd door metabolisme en/of getransporteerd naar de SubU/LP tijdens de blaas vulling om informatie naar neuronen en gladde spieren van de blaas te zenden en de prikkelbaarheid te reguleren tijdens continentie en mictie.
Introduction
Het doel van dit model is om directe toegang tot de submucosale kant van de blaas mucosa tijdens verschillende fasen van de blaas vulling mogelijk te maken.
De blaas moet afzien van voortijdige contractie tijdens het vullen en leeg zijn wanneer kritische volume en druk worden bereikt. Abnormale continentie of het vernietigen van urine worden vaak geassocieerd met abnormale prikkelbaarheid van de detrusor gladde spieren (DSM) in de loop van de blaas vulling. De prikkelbaarheid van DSM wordt bepaald door factoren die inherent zijn aan de gladde spiercellen en door invloeden die worden gegenereerd door verschillende celtypen binnen de blaaswand. De wand van de urineblaas bestaat uit urothelium (slijmvlies), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor gladde spieren (DSM) en serosa (Figuur 1a). Het urothelium bestaat uit paraplu cellen (d.w.z. de buitenste laag van het urothelium), intermediaire cellen en basale cellen (d.w.z. de binnenste laag van het urothelium). Verschillende soorten cellen, waaronder interstitiële cellen, fibroblasten, afferente zenuw terminals, kleine bloedvaten en immuuncellen bevinden zich in de SubU/LP. Er wordt algemeen verondersteld dat het blaas-urothelium een sensorisch orgaan is dat reflex mictie en continentie initieert door middel van mediatoren in de de die cellen in de subu/LP en de DSM1,2,3beïnvloeden. Voor het grootste deel zijn dergelijke veronderstellingen gebaseerd op studies die hebben aangetoond dat mediatoren vrijkomen: van stukjes slijmvlies blootgesteld aan veranderingen in hydrostatische druk4,5; van gekweekte oerotheliale cellen blootgesteld aan stretch6,7, hypotoniteit-geïnduceerde cel zwelling7 of sleep krachten8; van geïsoleerde blaaswand stroken op receptor of zenuw activatie9,10,11,12,13,14; en in blaas lumen aan het einde van de blaas vulling15,16,17,18,19. Hoewel dergelijke studies instrumentaal waren om het vrijkomen van bemiddel kers bij mechanische stimulatie van blaaswand segmenten of gekweekte oerotheliale cellen aan te tonen, moeten ze worden ondersteund door direct bewijs voor het vrijkomen van mediatoren in de de die wordt opgewekt door fysiologische stimuli die blaas vulling reproduceren. Dit is een uitdagende taak gezien het feit dat de SubU/LP zich diep in de blaaswand bevindt die de eenvoudige toegang tot de nabijheid van SubU/LP belemmert tijdens het vullen van de blaas.
Hier illustreren we een gedecentraliseerd (ex vivo) Murine blaas model met de detrusor spier verwijderd13 die werd ontwikkeld om studies te faciliteren over lokale mechanismen van mechanotransductie die deelnemen aan de signalering tussen de blaas-urothelium, DSM en andere celtypen in de blaaswand. Deze aanpak is superieur aan het gebruik van platte blaaswand vellen, blaaswand stroken of gekweekte urotheliale cellen, omdat het directe metingen toelaat in de nabijheid van SubU/LP van urothelium-afgeleide bemiddel kers die vrijkomen of gevormd worden als reactie op fysiologische druk en volumes in de blaas en voorkomt mogelijke fenotypische veranderingen in de celcultuur. Het kan worden gebruikt voor het meten van beschikbaarheid, vrijkomen, metabolisme en transurotheliaal transport van mediatoren in SubU/LP in verschillende stadia van blaas vulling (Figuur 1b). De bereiding kan ook worden gebruikt om de urotheliale signalering en mechanotransductie in modellen van overactieve en onderactieve blaas syndromen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De blaas heeft twee functies: opslag en het vernietigen van urine. De normale werking van deze functies vereist een goede mechanische detectie van het intraluminale volume en de druk en de transductie van signalen via cellen in de blaaswand om de prikkelbaarheid van de detrusor te reguleren. Het blaas slijmvlies (urothelium) wordt verondersteld om de blaas prikkelbaarheid te reguleren door het vrijgeven van een verscheidenheid van signalering moleculen in de subu/LP die invloed hebben op talrijke celtypen in de blaaswand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het National Institute of diabetes en spijsverterings-en nierziekten Grant DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
