En decentraliserad (ex vivo) murin urinblåsa modell med detrusor muskeln avlägsnas för direkttillgång till Suburothelium underblåsa fyllning
Summary
Den detrusor-fri blåsa modell möjliggör direkttillgång till suburothelium att studera lokala mekanismer för reglering av biologiskt aktiv medlare tillgänglighet i suburothelium/lamina propria under lagring och tömning av urin. Preparatet liknar fyllning av en intakt urinblåsa och gör att tryck volym studier kan utföras utan systemisk påverkan.
Abstract
Tidigare studier har etablerat frisättning av kemiska ämnen från platta urinblåsan slemhinna ark anbringas i Ussing kammare och utsätts för förändringar i hydrostatiska trycket eller mekanisk stretch och från odlade urotelcellscancer celler vid hydrostatiska trycket förändringar, stretch, cell svullnad, eller dragkrafter, och i urinblåsan lumen vid slutet av fyllning. Sådana fynd ledde till antagandet att dessa medlare också släpps i suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) underblåsa fyllning, där de påverkar celler djupt i urinblåsan väggen för att slutligen reglera urinblåsan retbarhet. Det finns minst två uppenbara begränsningar i sådana studier: 1) ingen av dessa metoder ger direkt information om närvaron av medlare i SubU/LP, och 2) de stimuli som används är inte fysiologiska och inte recapitulate autentiska fyllning av urinblåsan. Här diskuterar vi ett förfarande som möjliggör direkttillgång till suburotelial ytan av urinblåsan slemhinnan i samband med blåsa fyllning. Den murina detrusormuskeln-fri förberedelse vi skapade liknar fyllning av intakt urinblåsan och tillåter tryck-volym studier som skall utföras på urinblåsan i avsaknad av confounding signalering från spinal reflexer och detrusormuskeln glatt mus kula man. Med hjälp av romanen detrusor-Free blåsa modell, vi visade nyligen att intravesikal mätningar av medlare inte kan användas som en proxy till vad som har släppts eller finns i subu/LP underblåsa fyllning. Modellen möjliggör undersökning av urotel-härledda signalmolekyler som frigörs, genereras genom metabolism och/eller transporteras till SubU/LP under loppet av urinblåsan fyllning för att överföra information till nervceller och glatt mus kula i urinblåsan och reglera dess retbarhet under kontinens och micturition.
Introduction
Syftet med denna modell är att möjliggöra direkttillgång till submucosala sidan av urinblåsan slemhinnan under olika faser av urinblåsan fyllning.
Urinblåsan måste avstå från för tidig sammandragning under fyllning och tömma när kritisk volym och tryck uppnås. Onormal kontinens eller tömning av urin är ofta förknippade med onormal retbarhet av detrusormuskeln glatta muskeln (DSM) i samband med blåsa fyllning. Retbarhet av DSM bestäms av faktorer som är inneboende i glatta muskelceller och av influenser som genereras av olika celltyper i urinblåsan väggen. Väggen i urinblåsan består av urotel (slemhinna), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusormuskeln glattmuskulatur (DSM) och Serosa (figur 1a). Urotelet består av paraply celler (dvs. det yttersta skiktet av urotelet), mellanliggande celler, och basal celler (dvs. det innersta skiktet av urotelet). Olika typer av celler, inklusive interstitiella celler, fibroblaster, afferenta nervterminaler, små blodkärl, och immunceller bor i SubU/LP. Det är allmänt antas att urinblåsan urotelet är ett sensoriskt organ som initierar reflex urinering och kontinens genom att frigöra medlare i submucosa som påverkar celler i subu/lp och DSM1,2,3. För det mesta är sådana antaganden baserade på studier som har visat frisättning av medlare: från bitar av slemhinna som utsätts för förändringar i hydrostatiska trycket4,5; från odlade uroteliala celler som utsätts för stretch6,7, hypotonicitet-inducerad cell svullnad7 eller dragkrafter8; från isolerade blåsa vägg remsor på receptor-eller nerv aktivering9,10,11,12,13,14; och i urinblåsan lumen vid slutet av urinblåsan fyllning15,16,17,18,19. Medan sådana studier var avgörande för att demonstrera frisättning av medlare vid mekanisk stimulering av urinblåsan väggsegment eller odlade urotelceller, de måste stödjas av direkta bevis för frisättning av medlare i submucosa som framkallas av fysiologiska stimuli som reproducera blåsa fyllning. Detta är en utmanande uppgift med tanke på att SubU/LP ligger djupt i urinblåsan väggen hindrar enkel tillgång till närheten av SubU/LP underblåsa fyllning.
Här illustrerar vi en decentraliserad (ex vivo) murina urinblåsa modell med detrusormuskeln muskeln bort13 som utvecklades för att underlätta studier på lokala mekanismer för mechanotransduction som deltar i signalering mellan urinblåsan urotel, DSM och andra celltyper i urinblåsan väggen. Detta tillvägagångssätt är överlägsen med hjälp av platta urinblåsan vägg lakan, blåsa vägg remsor eller odlade urotelcellscancer celler eftersom det tillåter direkta mätningar i närheten av subu/lp av urotel-härledda medlare som släpps eller bildas som svar på fysiologiska tryck och volymer i urinblåsan och undviker potentiella fenotypiska förändringar i cellkulturen. Det kan användas för att mäta tillgänglighet, frisättning, metabolism och transurotelial transport av medlare i SubU/LP i olika stadier av blåsa fyllning (figur 1b). Preparatet kan också användas för att undersöka urotelial signalering och mechanotransduction i modeller av överaktiv och under aktiv blåsa syndrom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Urinblåsan har två funktioner: lagring och tömning av urin. Normal drift av dessa funktioner kräver ordentlig mekanisk avkänning av svalgmanometri volym och tryck och transduktion av signaler genom celler i urinblåsan väggen för att reglera detrusormuskeln muskel retbarhet. Urinblåsan slemhinnan (urotel) tros reglera urinblåsan retbarhet genom att släppa en mängd olika signalmolekyler i SubU/LP som påverkar många celltyper i urinblåsan väggen. För närvarande, de flesta försök till karakterisering av u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det nationella institutet för diabetes och mag-och njursjukdomar Grant DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
