Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen
Summary
Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm’s) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.
Abstract
Ubiquitin (UB) en ubiquitin-achtige (UBL) afhankelijke post-translationele modificaties van eiwitten spelen fundamentele biologische regelgevende rollen binnen de cel door het beheersen van de stabiliteit van het eiwit, activiteit, interacties en intracellulaire lokalisatie. Ze stellen de cel in staat om te reageren op signalen en zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving. Veranderingen binnen deze mechanismen kunnen leiden tot ernstige pathologische situaties zoals neurodegeneratieve ziekten en kankers. Het doel van de hier beschreven techniek is om UB/ubls afhankelijke PTMs-profielen, snel en nauwkeurig, uit gekweekte cellijnen vast te stellen. De vergelijking van verschillende profielen die uit verschillende omstandigheden zijn verkregen, maakt het mogelijk specifieke veranderingen te identificeren, zoals die welke worden veroorzaakt door bijvoorbeeld een behandeling. Lentivirale gemedieerde celtransductie wordt uitgevoerd om stabiele cellijnen te creëren die een twee-tags (6His en Flag) versie van de modifier uitdrukken (ubiquitin of een UBL zoals SUMO1 of Nedd8). Deze tags staan de zuivering van ubiquitine en dus van alomtegenwoordige eiwitten uit de cellen toe. Dit wordt gedaan door middel van een twee stappen zuiveringsproces: de eerste wordt uitgevoerd in denaturerende omstandigheden met behulp van de 6His tag, en de tweede in inheemse omstandigheden met behulp van de vlag tag. Dit leidt tot een zeer specifieke en zuivere isolatie van gemodificeerde eiwitten die vervolgens worden geïdentificeerd en semi-gekwantificeerd door vloeistofchromatografie, gevolgd door tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) technologie. Eenvoudige informatica analyse van MS-gegevens met behulp van Excel-software maakt het mogelijk PTM-profielen te creëren door achtergrond signalen te elimineren. Deze profielen worden vergeleken tussen elke aandoening om specifieke veranderingen te identificeren die dan specifieker bestudeerd zullen worden, te beginnen met hun validering door standaard biochemie technieken.
Introduction
De hier voorgestelde methode is gewijd aan het bestuderen van Ptm’s gemedieerd door de ubiquitine familieleden uit gekweekte zoogdiercellen om mogelijke veranderingen in verband met een specifieke aandoening te identificeren (behandeling, differentiatie, enz.). Ptm’s vertegenwoordigen de laatste stap in de regulering van de functies van eiwitten1. Inderdaad, eenmaal geproduceerd door de translationele machines, de meeste zo niet alle eiwitten ondergaan verschillende soorten Ptm’s die hun activiteit moduleren, moleculaire interacties, en intracellulaire locatie1. Onder de overvloed aan Ptm’s zijn degenen die worden bemiddeld door de ubiquitine familie van eiwitten, ubiquitine zelf en alle ubiquitine-likes, hebben het potentieel om alle intracellulaire of gedeeltelijk cytoplasmische eiwitten reguleren2. Omdat ze zelf eiwitten zijn, kunnen ze aan elkaar worden geconjugeerd, en vormen homogene en heterogene ketens van verschillende topologieën, elk geassocieerd met specifieke regelgevende functies2. Tools zijn nodig om te proberen om deze complexe machines te ontcijferen en te begrijpen. Veel benaderingen werden wereldwijd ontwikkeld, met hun eigen voor-en nadelen, en hier stellen we een met hoge prestaties geschikt voor gekweekte cellen.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is de nauwkeurigheid. Inderdaad, de zuiverheid van geïsoleerde gemodificeerde eiwitten wordt sterk verbeterd door het combinatorische gebruik van de twee tags (6his en vlag) en de twee stap-procedure en daarom is het veel selectiever dan een enkele tag Fusion UB/UBL3,4. De aanwezigheid van de 6His-tag maakt een eerste stap van zuivering mogelijk in een volledig denaturerende aandoening, waardoor elke co-zuivering van eiwitten die ubiquitine-bindende domeinen of andere eiwitten bevatten die aan de alomtegenwoordige stoffen binden, wordt vermeden. Dit is een technisch probleem dat wordt ondervonden door verschillende andere benaderingen op basis van affiniteits zuivering van alomtegenwoordige proteomes met behulp van specifieke antilichamen5 of tandem ubiquitine bindings elementen (buizen)6. Belangrijk is dat deze techniek niet bevooroordeeld is ten gunste van de zuivering van een bepaald type Ubiquitination, omdat het voor sommige andere benaderingen het geval zou kunnen zijn, omdat zowel mono als verschillende soorten polyubiquitinaties werden geïdentificeerd7. Als gevolg hiervan zal een wijziging van ubiquitatie in meer details moeten worden bestudeerd door standaard biochemische benaderingen om de exacte soort alomtegenwoordige activiteiten te identificeren.
Tot slot, een ander technisch voordeel van dit protocol is het gebruik van lentivirussen, dat gemakkelijk en snel creëert stabiele uitdrukken cellijnen met redelijke niveau van expressies van Tagged modifier zonder interfereren met de normale cellulaire gedrag.
Overwegende dat een belangrijke rol van ubiquitisatie is om eiwitten te richten op proteasomale afbraak, het is nu bekend dat het vele andere regulatoire eigenschappen heeft voor potentieel meest intracellulaire of gedeeltelijk intracellulaire eiwitten1. Het aantal van deze functies wordt verder versterkt door het bestaan van veel ubiquitine zoals eiwitten, het vormen van een familie van eiwitten die bijna elke cel mechanismen reguleren1. Hun wijzigingen kunnen drastische gevolgen hebben voor de celbiologie en kunnen leiden of deelnemen aan pathologische situaties8, zoals kanker9. Daarom zijn gereedschappen nodig om dit uitgestrekte landschap te verkennen en de veranderingen te identificeren die gepaard gaan met een pathologische aandoening die als nieuwe therapeutische doelen kan dienen.
Dit protocol is gewijd aan cellen in de cultuur, omdat ze moeten worden getransduceerde om exogene Tagged UB/UBL uit te drukken. Eenmaal gemaakt, kunnen deze stabiele cellijnen worden gebruikt om UBL-profielen te genereren van cultuur in 2D of 3D of xenografts, waardoor de horizon van de verschillende experimentele modellen die kunnen worden toegepast om PTMs-profielen te bestuderen, wordt verlengd.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een robuuste en betrouwbare methodologie ontwikkeld om profielen van eiwitten te genereren die zijn aangepast door de belangrijkste ubiquitine-familieleden. Inderdaad, we hebben dit protocol met succes toegepast om profielen van Ptm’s te genereren door ubiquitin, en ook door SUMO en Nedd8, en om veranderingen in verband met een behandeling te detecteren7, in reactie op de over expressie of knockdown van een bepaald gen (gegevens niet weergegeven) en in cellen die een resistent fenotype h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door la Ligue contre le Cancer aan HV en MS, en de ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer) aan PS, INCa (Institute National du Cancer) en Canceropole PACA naar JI. De massaspectrometrie faciliteit van Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) ondersteund door IBISA (infrastructuur Biologie santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, de Cancéropôle PACA, de Provence-Alpes-Côte d’Azur Regio, het Institut Paoli-Calmettes en het Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
