유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링
Summary
이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.
Abstract
유비퀴틴(ub) 및 유비퀴틴과 같은 (유블) 단백질의 의존적인 번역 후 변형은 단백질 안정성, 활동, 상호 작용 및 세포내 국소화를 조절함으로써 세포 내에서 근본적인 생물학적 조절 역할을 합니다. 그들은 세포가 신호에 응답하고 환경의 변화에 적응할 수 있게 합니다. 이 기계장치 내의 변경은 신경 퇴행성 질병 및 암과 같은 가혹한 병리상황으로 이끌어 낼 수 있습니다. 여기에 설명된 기술의 목적은 배양된 세포주로부터 ub/ubls 종속 PTM 프로파일을 신속하고 정확하게 확립하는 것입니다. 상이한 조건에서 수득된 상이한 프로파일의 비교는 예를 들어 치료에 의해 유도된 것과 같은 특정 변경의 식별을 허용한다. 렌티바이러스 매개 세포 트랜스덕션은 수식어(SUMO1 또는 Nedd8와 같은 유비퀴틴 또는 유블)의 2태그(6His 및 Flag) 버전을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하기 위해 수행된다. 이 꼬리표는 세포에서 유비퀴틴 및 그러므로 유비퀴틴 단백질의 정제를 허용합니다. 이것은 2 단계 정제 과정을 통해 수행됩니다 : 첫 번째는 6His 태그를 사용하여 변성 조건에서 수행되고 두 번째는 플래그 태그를 사용하여 기본 조건에서 수행됩니다. 이것은 이후에 확인되고 액체 크로마토그래피에 의해 반정화되고 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS) 기술에 선행되는 수정된 단백질의 고도로 특이하고 순수한 격리로 이끌어 냅니다. Excel 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터의 쉬운 정보학 분석을 통해 배경 신호를 제거하여 PTM 프로파일을 구축 할 수 있습니다. 이 단면도는 표준 생화학 기술에 의하여 그들의 검증으로 시작하여 그 때 더 구체적으로 공부될 특정 변경을 확인하기 위하여 각 조건 사이 비교됩니다.
Introduction
여기에서 제안된 방법은 특정 조건 (처리, 분화 등)와 관련되었던 잠재적인 변경을 확인하기 위하여 배양한 포유류 세포에서 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 중재된 PTM을 공부하기 위하여 전념합니다. PTM은 단백질의 기능 조절의 마지막 단계를 나타냅니다1. 실제로, 일단 번역 기계에 의해 생성된, 대부분의 경우 모든 단백질은 그들의 활동, 분자 상호 작용 및 세포내 위치1을조절하는 PTM의 다른 종류를 겪는다. PTM의 과다 중에는 단백질의 유비퀴틴 패밀리에 의해 매개되는 것들, 유비퀴틴 자체 및 모든 유비퀴틴-좋아하는 것들, 모든 세포내 또는 부분적으로 세포질 단백질을 조절할 수 있는 잠재력을 가지고있다 2. 그(것)들은 그들 자신 단백질이기 때문에, 그(것)들은 각각 특정 조절 기능과 관련되었던 다양한 topologies의 균질하고 이질적인 사슬을 형성하는, 서로 공액될 수 있습니다2. 이 복잡한 기계를 해독하고 이해하려면 도구가 필요합니다. 많은 접근법은 그들의 자신의 장점과 단점을 가지고, 전 세계적으로 개발되었다, 여기에서 우리는 배양 세포에 적합한 고성능 하나를 제안한다.
이 방법의 주요 장점은 정확성입니다. 실제로, 분리된 변형 된 단백질의 순도는 두 개의 태그 (6His 및 Flag)와 두 단계 절차의 조합 사용에 의해 매우 향상되므로 단일 태그 융합 Ub / Ubl3,4보다훨씬 더 선택적입니다. 6His 태그의 존재는 유비퀴틴 결합 도메인 또는 유비퀴틴 에 결합하는 다른 단백질을 함유하는 단백질의 공동 정제를 피함으로써 완전히 변성 조건에서 정제의 첫 번째 단계를 가능하게 한다. 이는 특정 항체5 또는 탠덤 유비퀴틴 결합 요소(TUBEs)6을사용하여 유비퀴틴화 된 프로테오옴의 친화도 정제에 기초한 여러 가지 다른 접근법에 의해 발생하는 기술적 문제이다. 중요한 것은, 이 기술은 모노와 다른 종류의 폴리쿼터시네이션이 모두 확인되었기 때문에, 다른 접근법의 경우일 수 있기 때문에, 특정 유형의 유비퀴틴화의 정제에 찬성하여 편향되지 않는다7. 따라서, 일단 발견되면, 유비퀴틴의 변경은 관련시킨 유비퀴틴의 정확한 종류를 확인하기 위하여 표준 생화확적인 접근에 의해 더 상세한 에서 공부되어야 할 것입니다.
마지막으로, 이 프로토콜의 또 다른 기술적 이점은 렌티바이러스를 사용하여 정상적인 세포 거동을 방해하지 않고 적절한 수준의 태그된 수정자의 발현을 통해 안정적이고 빠르게 세포주를 발현하는 것을 용이하게 생성합니다.
유비퀴틴화의 한 가지 중요한 역할은 프로테아소말 분해를 위한 단백질을 표적으로 하는 것이지만, 이제는 잠재적으로 대부분의 세포내 또는 부분적으로 세포내 단백질에 대한 많은 다른 조절 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다1. 이 기능의 수는 단백질 같이 많은 유비퀴틴의 존재에 의해 더 증강되고, 거의 모든 세포 기계장치를 통제하는 단백질의 가족을형성합니다 1. 그들의 변경은 세포 생물학에 과감한 영향을 미칠 수 있고 암9와같은 병리학적인 상황8을지도하거나 참여할 수 있습니다. 그러므로, 공구는 이 광대한 풍경을 탐구하고 새로운 치료 표적으로 봉사할 수 있는 병리학적인 상태와 관련되었던 변경을 확인하기 위하여 필요합니다.
이 프로토콜은 외인성 태그Ub/Ubl을 표현하기 위해 변환되어야 하기 때문에 배양되는 세포에 전념합니다. 일단 생성되면, 이러한 안정한 세포주는 2D 또는 3D 또는 이종이식에서 배양으로부터 Ubl 프로파일을 생성하는데 사용될 수 있으며, 따라서 PTM 프로파일을 연구하기 위해 적용될 수 있는 다양한 실험 모델의 지평을 확장할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 주요 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 변형 된 단백질의 프로파일을 생성하는 강력하고 신뢰할 수있는 방법론을 개발했습니다. 실제로, 우리는 성공적으로 유비퀴틴에 의해 PTM의 프로파일을 생성하기 위해이 프로토콜을 적용하고, 또한 SUMO와 Nedd8에 의해, 및 치료와 관련된 변경을감지하기위해 7 , 특정 유전자의 과잉 발현 또는 녹다운에 대한 응답으로 (데이터는 다양한 화?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 HV와 MS에 라 리그 콘트레 르 암에 의해 지원되었다, 그리고 ARC (협회는 PS에 라 recherche sur 르 암을 부어) PS, INCa (연구소 국립 두 암) 및 JI에 암로 폴 PACA. IBISA (인프라 바이오로지 산테 에 아그로노미), 플레이트포메 테크놀로지 엑스-마르세유, 칸세로폴레 PACA, 프로방스-알프스 코트 다쥐르가 지원하는 마르세유 프로테오믹스(marseille-proteomique.univ-amu.fr)의 질량 분석 시설 레지옹, 파올리-카메테스 연구소, 레체르슈 앙 칸세로로지 드 마르세유.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
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