Summary

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Published: November 07, 2019
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Summary

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Abstract

Las modificaciones post-traduccionales dependientes de la ubiquitina (ub) y la ubiquitina (ubl) dependientes de las proteínas desempeñan un papel regulador biológico fundamental dentro de la célula mediante el control de la estabilidad de las proteínas, la actividad, las interacciones y la localización intracelular. Permiten a la célula responder a las señales y adaptarse a los cambios en su entorno. Las alteraciones dentro de estos mecanismos pueden conducir a situaciones patológicas graves como enfermedades neurodegenerativas y cánceres. El objetivo de la técnica descrita aquí es establecer perfiles de PTF dependientes de ub/ubls, de forma rápida y precisa, a partir de líneas celulares cultivadas. La comparación de diferentes perfiles obtenidos a partir de diferentes condiciones permite la identificación de alteraciones específicas, como las inducidas por un tratamiento, por ejemplo. La transducción celular mediada por Lentiviral se realiza para crear líneas celulares estables que expresan una versión de dos etiquetas (6His y Flag) del modificador (ubiquitina o ubl como SUMO1 o Nedd8). Estas etiquetas permiten la purificación de la ubiquitina y por lo tanto de proteínas ubiquitinadas de las células. Esto se hace a través de un proceso de purificación de dos pasos: El primero se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando la etiqueta 6His, y el segundo en condiciones nativas usando la etiqueta Flag. Esto conduce a un aislamiento muy específico y puro de proteínas modificadas que posteriormente se identifican y semicuantifican mediante cromatografía líquida seguida de tecnología de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El fácil análisis informático de los datos de MS mediante el software Excel permite el establecimiento de perfiles PTM mediante la eliminación de señales de fondo. Estos perfiles se comparan entre cada condición con el fin de identificar alteraciones específicas que luego se estudiarán más específicamente, comenzando con su validación por técnicas de bioquímica estándar.

Introduction

El método propuesto aquí está dedicado a estudiar los PTM mediados por los miembros de la familia ubiquitina a partir de células de mamíferos cultivadas con el fin de identificar posibles alteraciones asociadas con una condición específica (tratamiento, diferenciación, etc.). Los PPT representan el último paso de regulación de las funciones de las proteínas1. De hecho, una vez producidas por la maquinaria traslacional, la mayoría, si no todas las proteínas, se someten a diferentes tipos de MPT que modulan su actividad, interacciones moleculares y ubicación intracelular1. Entre las plétolas de LOS PTM se encuentran las mediadas por la familia de proteínas ubiquitina, la ubiquitina en sí y todas las ubiquitinas, tienen el potencial de regular todas las proteínas intracelulares o parcialmente citoplasmáticas2. Debido a que son en sí mismas proteínas, se pueden conjugar entre sí, formando cadenas homogéneas y heterogéneas de diversas topologías, cada una asociada con funciones reguladoras específicas2. Se necesitan herramientas para tratar de descifrar y comprender esta compleja maquinaria. Muchos enfoques fueron desarrollados en todo el mundo, teniendo sus propias ventajas y desventajas, y aquí proponemos uno con alto rendimiento adecuado para células cultivadas.

La principal ventaja de este método es su precisión. De hecho, la pureza de las proteínas modificadas aisladas se ve muy mejorada por el uso combinatorio de las dos etiquetas (6His y Flag) y los dos pasos-procedimiento y por lo tanto es mucho más selectivo que una sola fusión de etiqueta Ub/Ubl3,4. La presencia de la etiqueta 6His permite un primer paso de purificación en una condición de desnaturalización completa evitando así cualquier co-purificación de proteínas que contengan dominios de unión a ubiquitina u otras proteínas que se unen a los ubiquitinados. Este es un problema técnico encontrado por varios otros enfoques basados en la purificación de afinidad de proteomes ubiquitinados utilizando anticuerpos específicos5 o elementos de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)6. Es importante destacar que esta técnica no está sesgada a favor de la purificación de un determinado tipo de ubiquitinación, como podría ser el caso de algunos otros enfoques, ya que se identificaron tanto mono como diferentes tipos de poliubiquitinaciones7. En consecuencia, una vez que se encuentre, una alteración de la ubiquitinación tendrá que ser estudiada en más detalle por enfoques bioquímicos estándar con el fin de identificar el tipo exacto de ubiquitinación involucrada.

Por último, otra ventaja técnica de este protocolo es el uso de lentivirus, que crea fácil y rápidamente líneas celulares de expresión estables con un nivel razonable de expresiones de modificador etiquetado sin interferir con el comportamiento celular normal.

Mientras que un papel importante de la ubiquitinación es apuntar a las proteínas para la degradación proteasomal, ahora se sabe que tiene muchas otras propiedades reguladoras para potencialmente la mayoría de las proteínas intracelulares o parcialmente intracelulares1. El número de estas funciones se incrementa aún más por la existencia de muchas ubiquitinas como proteínas, formando una familia de proteínas que regulan casi todos los mecanismos celulares1. Sus alteraciones pueden tener un impacto drástico en la biología celular y pueden conducir o participar en situaciones patológicas8,como el cáncer9. Por lo tanto, se necesitan herramientas para explorar este vasto paisaje e identificar las alteraciones asociadas con una condición patológica que podría servir como nuevas dianas terapéuticas.

Este protocolo está dedicado a las células en el cultivo ya que necesitan ser transducidas para expresar exógena etiquetada Ub/Ubl. Una vez creadas, estas líneas celulares estables se pueden utilizar para generar perfiles Ubl a partir de cultivos en 2D o 3D o xenoinjertos, extendiendo así el horizonte de los diferentes modelos experimentales que se pueden aplicar para estudiar perfiles de PTM.

Protocol

1. Generación de líneas celulares estables que expresan 6His-Flag-Ubl NOTA: Co-transfección de células HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG y delta-Helper. Día 0: Seed 293T células en una placa de 6 pocillos para obtener 50-70% de confluencia al día siguiente. Día 1: Células co-transfectas 50-70% de confluente con una mezcla de 1 g de pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g de pVSVG y 1 g de vectores delta-Helper, utilizando un reactivo de transfección y un protocolo para la pro…

Representative Results

Transducción de células de mamíferos de cultivo para crear células de expresión de GFP y 6HF-UbPara producir lentivirus que se utilizarán más adelante para transducir las células MiaPaCa-2, las células HEK-293T confluentes del 70% se co-transtan con la misma cantidad de los tres vectores, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Después de 24 h de producción, el medio que contiene partículas lentivirales se recupera y filtra. Es posible en este punto c…

Discussion

Hemos desarrollado una metodología robusta y fiable para generar perfiles de proteínas modificados por los principales miembros de la familia ubiquitina. De hecho, hemos aplicado con éxito este protocolo para generar perfiles de PTM según ubiquitina, y también por SUMO y Nedd8, y para detectar alteraciones asociadas con un tratamiento7,en respuesta a la sobreexpresión o derribo de un determinado gen (datos no y en las células que adquirieron un fenotipo resistente a diversos fármacos quimi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por La Ligue Contre le Cancer a HV y MS, y el ARC (association pour la recherche sur le cancer) a PS, INCa (instituto nacional del cáncer) y Canceropole PACA a JI. La instalación de espectrometría de masas de Marsella Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) con el apoyo de IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, la Cancéropéle PACA, la Provenza-Alpes-Costa Azul Région, el Institut Paoli-Calmettes y el Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

Materials

ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

References

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Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

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