Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes
Summary
Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l’ubiquitine (Ubquitin) et à l’ubiquitine (Ubls) afin d’identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu’un traitement ou un phénotype.
Abstract
Les modifications post-traductionnelles dépendantes de l’ubiquitine (ubl) des protéines jouent des rôles biologiques fondamentaux de régulation au sein de la cellule en contrôlant la stabilité des protéines, l’activité, les interactions et la localisation intracellulaire. Ils permettent à la cellule de répondre aux signaux et de s’adapter aux changements de son environnement. Les modifications au sein de ces mécanismes peuvent conduire à des situations pathologiques graves telles que les maladies neurodégénératives et les cancers. Le but de la technique décrite ici est d’établir des profils de PTMdépendants dépendants d’ub/ubls, rapidement et exactement, des lignées cellulaires cultivées. La comparaison de différents profils obtenus à partir de différentes conditions permet d’identifier des altérations spécifiques, telles que celles induites par un traitement par exemple. La transduction des cellules médiées lentivirales est effectuée pour créer des lignées cellulaires stables exprimant une version à deux étiquettes (6His et Drapeau) du modificateur (ubiquitine ou ubl comme SUMO1 ou Nedd8). Ces étiquettes permettent la purification de l’ubiquitine et donc des protéines ubiquitinated des cellules. Cela se fait par un processus de purification en deux étapes: Le premier est effectué dans des conditions dénaturantes en utilisant l’étiquette 6His, et le second dans des conditions natives en utilisant l’étiquette drapeau. Cela conduit à un isolement très spécifique et pur des protéines modifiées qui sont ensuite identifiées et semi-quantifiées par chromatographie liquide suivie par la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) technologie. L’analyse informatique facile des données De SP à l’aide du logiciel Excel permet l’établissement de profils PTM en éliminant les signaux d’arrière-plan. Ces profils sont comparés entre chaque condition afin d’identifier des altérations spécifiques qui seront ensuite étudiées plus spécifiquement, à commencer par leur validation par des techniques de biochimie standard.
Introduction
La méthode proposée ici est dédiée à l’étude des PTM médiées par les membres de la famille de l’ubiquitine à partir de cellules de mammifères cultivées afin d’identifier les altérations potentielles associées à une condition spécifique (traitement, différenciation, etc.). Les PTM représentent la dernière étape de la régulation des fonctions des protéines1. En effet, une fois produites par la machinerie translationnelle, la plupart sinon toutes les protéines subissent différents types de PTM qui modulent leur activité, interactions moléculaires, et emplacement intracellulaire1. Parmi la pléthore de PTM sont ceux médiés par la famille d’ubiquitine de protéines, l’ubiquitine elle-même et toutes les ubiquitine-likes, ont le potentiel de réguler toutes les protéines intracellulaires ou partiellement cytoplasmiques2. Parce qu’elles sont elles-mêmes des protéines, elles peuvent être conjuguées les unes aux autres, formant des chaînes homogènes et hétérogènes de diverses topologies, chacune associée à des fonctions réglementaires spécifiques2. Des outils sont nécessaires pour essayer de déchiffrer et de comprendre cette machinerie complexe. Beaucoup d’approches ont été développées dans le monde entier, ayant leurs propres avantages et inconvénients, et ici nous proposons un avec la haute performance adaptée aux cellules cultivées.
Le principal avantage de cette méthode est sa précision. En effet, la pureté des protéines modifiées isolées est fortement améliorée par l’utilisation combinatoire des deux étiquettes (6His et Flag) et les deux étapes-procédure et donc il est beaucoup plus sélectif qu’une seule étiquette fusion Ub/Ubl3,4. La présence de l’étiquette 6His permet une première étape de purification dans un état totalement dénaturant évitant ainsi toute co-purification des protéines contenant des domaines de liaison d’ubiquitine ou d’autres protéines se liant aux ubiquitinated. Il s’agit d’un problème technique rencontré par plusieurs autres approches basées sur la purification d’affinité des protéomes ubiquitinated utilisant des anticorps spécifiques5 ou des éléments de liaison d’ubiquitine de tandem (TUBEs)6. Fait important, cette technique n’est pas biaisée en faveur de la purification d’un certain type d’ubiquitination, comme cela pourrait être le cas pour d’autres approches, puisque les deux types de mono et différents types de polyubiquitinations ont été identifiés7. Par conséquent, une fois trouvé, une altération de l’ubiquitination devra être étudiée plus en détail par des approches biochimiques standard afin d’identifier le type exact d’ubiquitination impliquée.
Enfin, un autre avantage technique de ce protocole est l’utilisation de lentivirus, qui crée facilement et rapidement des lignées cellulaires stables exprimant avec un niveau raisonnable d’expressions de modificateur marqué sans interférer avec le comportement cellulaire normal.
Alors qu’un rôle important de l’ubiquitination est de cibler les protéines pour la dégradation protéasomale, il est maintenant connu qu’il a de nombreuses autres propriétés réglementaires pour potentiellement la plupart des protéines intracellulaires ou partiellement intracellulaires1. Le nombre de ces fonctions est encore augmenté par l’existence de nombreuses ubiquitines comme les protéines, formant une famille de protéines régulant presque tous les mécanismes cellulaires1. Leurs altérations peuvent avoir un impact drastique sur la biologie cellulaire et peuvent conduire ou participer à des situations pathologiques8, comme le cancer9. Par conséquent, des outils sont nécessaires pour explorer ce vaste paysage et identifier les altérations associées à une condition pathologique qui pourrait servir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Ce protocole est dédié aux cellules en culture car elles doivent être transduisées pour exprimer exogène marqué Ub / Ubl. Une fois créées, ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisées pour générer des profils Ubl à partir de la culture en 2D ou 3D ou xénogreffes, prolongeant ainsi l’horizon des différents modèles expérimentaux qui peuvent être appliqués pour étudier les profils ptMs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé une méthodologie robuste et fiable pour générer des profils de protéines modifiées par les principaux membres de la famille de l’ubiquitine. En effet, nous avons appliqué avec succès ce protocole pour générer des profils de PTM par ubiquitine, mais aussi par SUMO et Nedd8, et pour détecter les altérations associées à un traitement7, en réponse à la surexpression ou à l’élimination d’un certain gène (données non montré) et dans les cellules qui ont acquis …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par La Ligue Contre le Cancer au VH et à la SP, et l’ARC (association pour la recherche sur le cancer) à PS, INCa (Institut national du cancer) et Canceropole PACA à JI. Le site de spectrométrie de masse de Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) soutenu par IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d’Azur Région, l’Institut Paoli-Calmettes et le Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
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