Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas
Summary
Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.
Abstract
Ubiquitina (ub) e ubiquitina-like (ubl) modificações pós-translacionais dependentes de proteínas desempenham papéis fundamentais de regulamentação biológica dentro da célula, controlando a estabilidade de proteínas, atividade, interações e localização intracelular. Eles permitem que a célula responda aos sinais e se adapte às mudanças em seu ambiente. Alterações nesses mecanismos podem levar a situações patológicas graves, como doenças neurodegenerativas e cânceres. O objetivo da técnica descrita aqui é estabelecer perfis de PTMs dependentes ub/ubls, de forma rápida e precisa, a partir de linhas celulares cultivadas. A comparação de diferentes perfis obtidos de diferentes condições permite a identificação de alterações específicas, como as induzidas por um tratamento, por exemplo. A transdução de células mediadas lentivirais é realizada para criar linhas celulares estáveis expressando uma versão de duas tags (6His e Flag) do modificador (ubiquitina ou um ubl como SUMO1 ou Nedd8). Essas marcas permitem a purificação da ubiquitina e, portanto, de proteínas ubiquitinadas das células. Isso é feito através de um processo de purificação de duas etapas: O primeiro é realizado em condições de desestruturação usando a tag 6His, e o segundo em condições nativas usando a tag Flag. Isso leva a um isolamento altamente específico e puro de proteínas modificadas que são posteriormente identificadas e semiquantificadas por cromatografia líquida seguida saqueade sem espectrometria de massa (LC-MS/MS) tecnologia. A análise de informática fácil dos dados de EM usando o software Excel permite o estabelecimento de perfis PTM eliminando sinais de fundo. Esses perfis são comparados entre cada condição, a fim de identificar alterações específicas que serão estudadas mais especificamente, começando com sua validação por técnicas de bioquímica padrão.
Introduction
O método aqui proposto é dedicado ao estudo de PTMs mediados pelos membros da família ubiquitina de células de mamíferos cultivadas, a fim de identificar potenciais alterações associadas a uma condição específica (tratamento, diferenciação, etc). Os PTMs representam o último passo da regulação das funções das proteínas1. De fato, uma vez produzido pelas máquinas translacionais, a maioria, se não todas as proteínas, passam por diferentes tipos de PTMs que modulam sua atividade, interações moleculares e localização intracelular1. Entre a pletora de PTMs estão os mediados pela família ubiquitinde de proteínas, ubiquitina em si e todos os ubiquitina-likes, têm o potencial de regular todas as proteínas intracelulares ou parcialmente citoplasmic2. Por serem proteínas, elas podem ser conjugadas entre si, formando cadeias homogêneas e heterogêneas de diversas topologias, cada uma associada a funções regulatórias específicas2. Ferramentas são necessárias para tentar decifrar e entender essa máquina complexa. Muitas abordagens foram desenvolvidas em todo o mundo, tendo suas próprias vantagens e desvantagens, e aqui propomos uma com alto desempenho adequado para células cultivadas.
A principal vantagem deste método é a sua precisão. Na verdade, a pureza das proteínas modificadas isoladas é altamente melhorada pelo uso combinatório das duas tags (6His e Flag) e os dois passos de procedimento e, portanto, é muito mais seletivo do que uma única marca de fusão Ub / Ubl3,4. A presença da tag 6Sua permite um primeiro passo de purificação em uma condição totalmente desativação, evitando assim qualquer co-purificação de proteínas contendo domínios de ligação ubiquitina ou outras proteínas que se ligam aos ubiquitinados. Este é um problema técnico encontrado por várias outras abordagens com base na purificação de afinidade de proteomas ubiquitinados usando anticorpos específicos5 ou elementos de ligação à ubiquitina tandem (TUBEs)6. Importante, esta técnica não é tendenciosa em favor da purificação de um certo tipo de ubiquitinação, como poderia ser o caso de algumas outras abordagens, uma vez que tanto mono e diferentes tipos de polionionciações foram identificados7. Consequentemente, uma vez encontrado, uma alteração da ubiquitinação terá que ser estudada em mais detalhes por abordagens bioquímicas padrão, a fim de identificar o tipo exato de ubiquitinação envolvida.
Finalmente, outra vantagem técnica deste protocolo é o uso de lentivírus, que cria facilmente e rapidamente linhas celulares expressantes estáveis com nível razoável de expressões de modificador marcado sem interferir com o comportamento celular normal.
Considerando que um papel importante da ubiquitinação é direcionar proteínas para degradação proteassômica, sabe-se agora que tem muitas outras propriedades regulatórias para proteínas potencialmente intracelulares ou parcialmente intracelulares1. O número dessas funções é ainda mais aumentado pela existência de muitas ubiquitinas como proteínas, formando uma família de proteínas que regulam quase todos os mecanismos celulares1. Suas alterações podem ter impacto drástico na biologia celular e podem levar ou participar de situações patológicas8,como o câncer9. Assim, são necessárias ferramentas para explorar esta vasta paisagem e identificar as alterações associadas a uma condição patológica que poderia servir como novos alvos terapêuticos.
Este protocolo é dedicado às células da cultura, uma vez que precisam ser transduzidas para expressar ub/Ubl marcados exógenos. Uma vez criadas, essas linhas celulares estáveis podem ser usadas para gerar perfis Ubl a partir da cultura em 2D ou 3D ou xenoenxertos, ampliando assim o horizonte dos diferentes modelos experimentais que podem ser aplicados para estudar perfis de PTMs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos uma metodologia robusta e confiável para gerar perfis de proteínas modificadas pelos principais membros da família ubiquitina. Na verdade, aplicamos com sucesso esse protocolo para gerar perfis de PTMs por ubiquitina, e também pela SUMO e Nedd8, e para detectar alterações associadas a um tratamento7,em resposta à expressão excessiva ou knockdown de um determinado gene (dados não mostrado) e em células que adquiriram um fenótipo resistente a diversos medicamentos quimioter?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por La Ligue Contre le Cancer para HV e MS, e a ARC (associação pour la recherche sur le cancer) para PS, INCa (institute national du cancer) e Canceropole PACA to JI. A instalação de espectrometria de massa de Marselha Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) apoiada pela IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, o Cancéropôle PACA, provence-Alpes-Côte d’Azur Région, o Institut Paoli-Calmettes e o Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
