Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro
Summary
Denne protokol genererer biopartikel mikroarrays, der giver rumligt kontrolleret neutrofil sværmer. Det giver nem adgang til de mæglere, neutrofiler frigive under migration og giver mulighed for kvantitative billeddannelse analyse.
Abstract
Neutrofil sværmer er et kooperativ proces, hvorved neutrofiler forsegle et sted for infektion og fremme væv reorganisering. Sværmer er klassisk blevet undersøgt in vivo i dyremodeller, der viser karakteristiske mønstre for cellemigration. Men in vivo modeller har flere begrænsninger, herunder intercellulære mæglere, der er vanskelige at få adgang til og analysere, samt den manglende evne til direkte at analysere menneskelige neutrofiler. På grund af disse begrænsninger er der behov for en in vitro-platform, der studerer sværmer med menneskelige neutrofiler og giver nem adgang til de molekylære signaler, der genereres under sværmer. Her, en multistep mikrostamping proces bruges til at generere en biopartikel mikroarray, der stimulerer sværmer ved at efterligne en in vivo infektion. Biopartikelmikrosystemet får neutrofiler til at sværme på en kontrolleret og stabil måde. På mikroarray, neutrofiler stigning i hastighed og danne stabile sværme omkring biopartikel klynger. Derudover blev supernatant genereret af neutrophils analyseret og 16 proteiner blev opdaget at være blevet differentieret udtrykt i løbet af sværmer. Denne in vitro sværmer platform letter direkte analyse af neutrofile migration og protein frigivelse på en reproducerbar, rumligt kontrolleret måde.
Introduction
Neutrophils, den mest rigelige hvide blodlegemer i blodbanen1,får opmærksomhed som potentielle diagnostiske og terapeutiske mål2,3 fordi de kan være involveret i en række medicinske tilstande, herunder gigt4,sepsis3,traumer5,6,kræft1,7,8, og forskellige autoimmune sygdomme5,9. Neutrofil sværmer er en flertrins, stramt reguleret proces med en kompleksitet, der gør det til et særligt interessant fokus for studie5,10,11. Under sværmer, neutrofiler isolere et sted af betændelse fra det omgivende sunde væv5,10,11. Korrekt regulering af neutrofil sværmer er afgørende for at fremme sårheling og i sidste ende inflammation opløsning5,12. Neutrophil sværmer er primært blevet undersøgt in vivo i gnaver12,13,14,15 og zebrafisk10,11,12,15 modeller. Arten af disse in vivo dyremodeller giver imidlertid anledning til begrænsninger5. For eksempel er de mæglere udgivet af neutrofiler under sværmer ikke let tilgængelige for analyse5. Derudover er der mange potentielle kilder til en given mægler in vivo, så en in vivo eksperiment skal indføre en genetisk mangel for at hæmme cellulære produktion og / eller interaktion med henblik på at undersøge den rolle, som mægler i en given proces13. Et in vitro-eksperiment omgår denne komplikation ved at muliggøre neutrofilobservation uden yderligere cellers kontekst. Derudover er forskning, der beskriver menneskelig neutrofil koordineret migration begrænset16. På en in vitro sværmer platform, menneskelige neutrofiler kan analyseres direkte. En in vitro sværmer platform kunne udvide den viden, der opnås fra in vivo undersøgelser ved at give muligheder for at udfylde de huller efterladt af begrænsningerne i in vivo undersøgelser.
For at imødekomme behovet for en in vitro-platform, der efterligner in vivo neutrophil sværmer, udviklede vi en mikrostamping platform, der gør det muligt for os at mønstre biopartikel mikroarrays, der stimulerer neutrofil sværmer på en rumligt kontrolleret måde. Vi genererer biopartikelmikroarrays på glasdias i en to-trins proces. For det første bruger vi microstamping til at generere en mikroarray af kationiske polyelektrolyt (CP) pletter. For det andet tilføjer vi en opløsning af biopartikler, der klæber til CP-pletterne via elektrostatisk interaktion. Ved først at mønstre CP lag, kan vi selektivt mønster negativt ladede biopartikler til at generere den ønskede neutrofile sværmer mønster. Det positivt ladede lag holder de negativt ladede biopartikler gennem det kraftige vasketrin, der fjerner biopartiklerne fra områderne på glasslidsen, der ikke har CP. Desuden er cp’en, der anvendes her, en copolymer af acrylamid og kvatisk kationisk monomer, biokompatibel, så det fremkalder ikke et svar fra neutrofile. Det har en meget høj overflade afgift, der immobiliserer mikron-størrelse biopartikler til glasset dias, hvilket hæmmer neutrofiler fra at fjerne partiklerfra den mønstrede position på glasset dias. Dette resulterer i biopartikelklynger arrangeret i et mikroarray. Da vi tilføjede neutrofiler til mikroarrayet, dannede de stabile sværme omkring biopartikelklyngerne. Gennem sporing neutrofile migration, fandt vi, at sværmer neutrofiler aktivt migrere mod biopartikel klynger. Desuden brugte vi denne platform til at analysere visse mæglere, at neutrofiler frigivelse under sværmer. Vi fandt 16 mæglere, der er forskelligt udtrykt under sværmer. Deres koncentrationer følger tre generelle tendenser over tid: stigning, fald, eller spike. Vores in vitro neutrofile sværmer platform letter analysen af rumligt kontrolleret human neutrofil sværmer, samt indsamling og analyse af mæglere udgivet af neutrofil sværmer. I en tidligere publikation, viste vi, at patienter med visse medicinske tilstande (traumer, autoimmunsygdom, og sepsis), havde neutrofiler, der fungerede anderledes end dem fra raske donorer5. I fremtidige forskningsundersøgelser, vores platform kunne bruges til at analysere neutrofile funktion blandt en række patientpopulationer. Denne platform kan kvantitativt analysere den komplekse koordinering, der er involveret i neutrofil sværmer. Yderligere undersøgelser kan gøres for at give indsigt i neutrofil funktionen af en bestemt patientpopulation eller neutrofile reaktion på et patogen af interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udviklede en mikrostamping platform til at generere ensartede arrays af biopartikler til at stimulere in vitro neutrophil sværmer. In vitro karakter af vores platform giver os mulighed for at omgå de komplikationer, der opstår med in vivo sværmer eksperimenter, nemlig den dårlige evne til at analysere mæglere frigivet af sværmer neutrophils5. Derudover udføres in vivo-modeller typisk i gnavere11,12,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering og Comprehensive Cancer Center på The Ohio State University. Data præsenteret i denne rapport kom fra billeder behandlet ved hjælp af Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) tilgængelige på Campus Mikroskopi og Imaging Facility, The Ohio State University. Denne facilitet støttes til dels ved tilskud P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
