Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro
Summary
Este protocolo genera microarrays de biopartículas que proporcionan enjambre de neutrófilos controlado espacialmente. Proporciona un fácil acceso a los mediadores que los neutrófilos liberan durante la migración y permite el análisis cuantitativo de imágenes.
Abstract
El enjambre de neutrófilos es un proceso cooperativo por el cual los neutrófilos cierran un sitio de infección y promueven la reorganización de los tejidos. El enjambre se ha estudiado clásicamente in vivo en modelos animales que muestran patrones característicos de migración celular. Sin embargo, los modelos in vivo tienen varias limitaciones, incluyendo mediadores intercelulares que son difíciles de acceder y analizar, así como la incapacidad de analizar directamente a los neutrófilos humanos. Debido a estas limitaciones, es necesario una plataforma in vitro que estudia el enjambre de neutrófilos humanos y proporcione un fácil acceso a las señales moleculares generadas durante el enjambre. Aquí, un proceso de microsello de varios pasos se utiliza para generar un microarray de biopartículas que estimula el enjambre imitando una infección in vivo. El microarray de biopartículas induce a los neutrófilos a enjambre de una manera controlada y estable. En el microarray, los neutrófilos aumentan en velocidad y forman enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. Además, se analizó el sobrenadante generado por los neutrófilos y se descubrió que 16 proteínas se expresaron diferencialmente en el transcurso del enjambre. Esta plataforma de enjambre in vitro facilita el análisis directo de la migración de neutrófilos y la liberación de proteínas de una manera reproducible y controlada espacialmente.
Introduction
Los neutrófilos, el glóbulo blanco más abundante en el torrente sanguíneo1, están ganando atención como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas2,3 porque pueden estar involucrados en una variedad de condiciones médicas incluyendo gota4, sepsis3, trauma5,6, cáncer1,7,8, y diversas enfermedades autoinmunes5,9. El enjambre de neutrófilos es un proceso multietapa, estrechamenteregulado con una complejidad que lo convierte en un foco particularmente interesante de estudio5,10,11. Durante el enjambre, los neutrófilos aíslan un sitio de inflamación del tejido sano circundante5,10,11. La regulación adecuada del enjambre de neutrófilos es esencial para promover la cicatrización de heridas y, en última instancia, la resolución de inflamación5,12. El enjambre de neutrófilos se ha estudiado principalmente in vivo en roedores12,13,14,15 y pez cebra10,11,12,15 modelos. Sin embargo, la naturaleza de estos modelos animales in vivo da lugar a limitaciones5. Por ejemplo, los mediadores liberados por neutrófilos durante el enjambre no son fácilmente accesibles para el análisis5. Además, hay muchas fuentes potenciales para un mediador dado in vivo, por lo que un experimento in vivo debe introducir una deficiencia genética para inhibir la producción celular y / o la interacción con el fin de investigar el papel de ese mediador en un proceso dado13. Un experimento in vitro elude esta complicación al permitir la observación de neutrófilos sin el contexto de células adicionales. Además, la investigación que describe la migración coordinada por neutrófilos humanos es limitada16. En una plataforma de enjambre in vitro, los neutrófilos humanos pueden ser analizados directamente. Una plataforma de enjambre in vitro podría ampliar los conocimientos adquiridos a partir de estudios in vivo proporcionando oportunidades para llenar las lagunas que dejan las limitaciones de los estudios in vivo.
Para hacer frente a la necesidad de una plataforma in vitro que imita el enjambre de neutrófilos in vivo, desarrollamos una plataforma de microsello que nos permite patrones de microarrays de biopartículas que estimulan el enjambre de neutrófilos de una manera controlada espacialmente. Generamos microarrays de biopartículas en portaobjetos de vidrio en un proceso de dos pasos. En primer lugar, utilizamos microestampado para generar un microarray de puntos de polielectrolito catiónico (CP). En segundo lugar, añadimos una solución de biopartículas que se adhieren a los puntos CP a través de la interacción electrostática. Al crear primero el patrón de la capa CP, podemos patrón selectivo de biopartículas cargadas negativamente para generar el patrón de enjambre de neutrófilos deseado. La capa cargada positivamente contiene las biopartículas cargadas negativamente a través del vigoroso paso de lavado que elimina las biopartículas de las áreas en el tobogán de vidrio que no tienen el CP. Tiene una carga superficial muy alta que inmoviliza las biopartículas del tamaño de un micron al portaobjetos de vidrio, inhibiendo así a los neutrófilos de eliminar las partículas de la posición patrón en el portaobjetos de vidrio. Esto da como resultado racimos de biopartículas dispuestos en un microarray. Cuando añadimos neutrófilos al microarray, formaron enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. A través del seguimiento de la migración de neutrófilos, descubrimos que los neutrófilos enjambres migran activamente hacia los cúmulos de biopartículas. Además, utilizamos esta plataforma para analizar ciertos mediadores que los neutrófilos liberan durante el enjambre. Encontramos 16 mediadores que se expresan diferencialmente durante el enjambre. Sus concentraciones siguen tres tendencias generales a lo largo del tiempo: aumento, disminución o pico. Nuestra plataforma de enjambre de neutrófilos in vitro facilita el análisis del enjambre de neutrófilos humanos controlado espacialmente, así como la recopilación y análisis de mediadores liberados por enjambre de neutrófilos. En una publicación anterior, demostramos que los pacientes con ciertas condiciones médicas (trauma, enfermedad autoinmune y sepsis), tenían neutrófilos que funcionaban de manera diferente a los de los donantes sanos5. En futuros estudios de investigación, nuestra plataforma podría utilizarse para analizar la función de neutrófilos entre una variedad de poblaciones de pacientes. Esta plataforma puede analizar cuantitativamente la compleja coordinación involucrada en el enjambre de neutrófilos. Se pueden realizar estudios adicionales para proporcionar información sobre la función neutrófila de una población de pacientes específica o la respuesta de neutrófilos a un patógeno de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos una plataforma de microsello para generar matrices uniformes de biopartículas para estimular el enjambre de neutrófilos in vitro. La naturaleza in vitro de nuestra plataforma nos permite eludir las complicaciones que surgen con los experimentos in vivo enjambre, a saber, la mala capacidad para analizar los mediadores liberados por los neutrófilos enjambres5. Además, los modelos in vivo se realizan típicamente en roedores11,12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento William G. Lowrie de Ingeniería Química y Biomolecular y el Centro Integral del Cáncer de la Universidad Estatal de Ohio. Los datos presentados en este informe provienen de imágenes procesadas con Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponibles en el Centro de Microscopía e Imagen del Campus, La Universidad Estatal de Ohio. Esta instalación es apoyada en parte por la subvención P30 CA016058, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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