Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro
Summary
Dieses Protokoll erzeugt Biopartikel-Mikroarrays, die räumlich gesteuerte Neutrophilenschwärme nerieren. Es bietet einfachen Zugriff auf die Mediatoren, die Neutrophile während der Migration freisetzen, und ermöglicht quantitative Bildgebungsanalysen.
Abstract
NeutrophileSchwärme ist ein kooperatives Verfahren, durch das Neutrophile eine Infektionsstelle abdichten und die Gewebereorganisation fördern. Swarming wurde klassischerweise in vivo in Tiermodellen untersucht, die charakteristische Muster der Zellmigration zeigen. In-vivo-Modelle weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, darunter interzelluläre Mediatoren, die schwer zugänglich sind und analysiert werden können, sowie die Unfähigkeit, menschliche Neutrophile direkt zu analysieren. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine In-vitro-Plattform erforderlich, die das Schwärmen mit menschlichen Neutrophilen untersucht und einen einfachen Zugang zu den molekularen Signalen bietet, die während des Schwärmens erzeugt werden. Hier wird ein mehrstufiger Mikrostamping-Prozess verwendet, um ein Biopartikel-Mikroarray zu erzeugen, das das Schwärmen stimuliert, indem es eine In-vivo-Infektion imitiert. Das Biopartikel-Mikroarray induziert Neutrophile, um kontrolliert und stabil zu schwärmen. Auf dem Mikroarray erhöhen Neutrophile die Geschwindigkeit und bilden stabile Schwärme um Biopartikelhaufen. Zusätzlich wurde überstand, überstanden von den Neutrophilen analysiert und 16 Proteine wurden entdeckt, dass sie im Laufe des Schwärmens differenziell exprimiert wurden. Diese In-vitro-Schwärmeplattform ermöglicht die direkte Analyse der Neutrophilenmigration und Proteinfreisetzung auf reproduzierbare, räumlich kontrollierte Weise.
Introduction
Neutrophile, die am häufigsten vorkommende weiße Blutkörperchen im Blut1, gewinnen Aufmerksamkeit als potenzielle diagnostische und therapeutische Ziele2,3, weil sie in einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt sein können, einschließlich Gicht4, Sepsis3, Trauma5,6, Krebs 1,7,8, und verschiedene Autoimmunerkrankungen5,9. Neutrophiles Schwärmen ist ein mehrstufiger, streng regulierter Prozess mit einer Komplexität, die ihn zu einem besonders interessanten Schwerpunkt der Studie5,10,11macht. Während des Schwärmens isolieren Neutrophilen eine Entzündungsstelle aus dem umgebenden gesunden Gewebe5,10,11. Richtige Regulierung der neutrophilen Schwärmeist ist wichtig, um die Wundheilung und letztlich Entzündungsauflösung5,12zu fördern. Neutrophile Schwärmen wurde in erster Linie in vivo bei Nagetier12,13,14,15 und Zebrafisch10,11,12,15 Modelle untersucht. Die Art dieser in vivo Tiermodelle führt jedoch zu Einschränkungen5. Zum Beispiel sind die Von Neutrophilen während des Schwärmens freigesetzten Mediatoren für die Analyse5nicht leicht zugänglich. Darüber hinaus gibt es viele potenzielle Quellen für einen bestimmten Mediator in vivo, so dass ein In-vivo-Experiment einen genetischen Mangel einführen muss, um die zelluläre Produktion und/oder Interaktion zu hemmen, um die Rolle dieses Mediators in einem bestimmten Prozess zu untersuchen13. Ein In-vitro-Experiment umgeht diese Komplikation, indem es eine neutrophile Beobachtung ohne den Kontext zusätzlicher Zellen ermöglicht. Zusätzlich ist die Forschung zur Beschreibung der koordinierten Migration durch menschliche neutrophile begrenzt16. Auf einer In-vitro-Schwärmeplattform können menschliche Neutrophile direkt analysiert werden. Eine In-vitro-Schwärmeplattform könnte das Wissen aus In-vivo-Studien erweitern, indem sie Möglichkeiten bietet, die Lücken zu schließen, die die Grenzen von In-vivo-Studien hinterlassen haben.
Um der Notwendigkeit einer In-vitro-Plattform gerecht zu werden, die in vivo neutrophilen Schwärmen imitiert, haben wir eine Mikrostamping-Plattform entwickelt, die es uns ermöglicht, Biopartikel-Mikroarrays zu mustern, die das Neutrophilschwärmen in einer räumlich kontrollierten Weise stimulieren. Wir erzeugen Biopartikel-Mikroarrays auf Glasrutschen in einem zweistufigen Prozess. Zunächst verwenden wir Mikrostamping, um ein Mikroarray von kationischen Polyelektrolyten (CP)-Spots zu erzeugen. Zweitens fügen wir eine Lösung von Biopartikeln hinzu, die über eine elektrostatische Interaktion an den CP-Spots haften. Durch das erste Mustern der CP-Schicht können wir negativ geladene Biopartikel selektiv mustern, um das gewünschte neutrophile Schwarmmuster zu erzeugen. Die positiv geladene Schicht hält die negativ geladenen Biopartikel durch den kräftigen Waschschritt, der die Biopartikel aus den Bereichen auf dem Glasschlitten entfernt, die nicht über den CP verfügen. Zusätzlich ist der hier verwendete CP, ein Copolymer aus Acrylamid und quaternisiertem kationischen Monomer, biokompatibel, so dass es keine Reaktion der Neutrophilen induziert. Es hat eine sehr hohe Oberflächenladung, die die mikrongroßen Biopartikel zum Glasschlitten immobilisiert und so Neutrophilen daran hindert, die Partikel aus der gemusterten Position auf dem Glasschlitten zu entfernen. Dies führt zu Biopartikel-Clustern, die in einem Mikroarray angeordnet sind. Als wir dem Mikroarray Neutrophilen hinzufügten, bildeten sie stabile Schwärme um die Biopartikelhaufen. Durch die Verfolgung der Neutrophilenmigration fanden wir heraus, dass schwärmende Neutrophilen aktiv in richtungsumhergehende Biopartikel-Cluster. Darüber hinaus nutzten wir diese Plattform, um bestimmte Mediatoren zu analysieren, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen. Wir fanden 16 Mediatoren, die während des Schwärmens unterschiedlich ausgedrückt werden. Ihre Konzentrationen folgen drei allgemeinen Trends im Laufe der Zeit: Anstieg, Abnahme oder Spitze. Unsere in vitro neutrophile Schwärmeungsplattform erleichtert die Analyse des räumlich gesteuerten menschlichen Neutrophilenschwärmens sowie die Sammlung und Analyse von Mediatoren, die durch neutrophilesches Schwärmen freigesetzt werden. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, dass Patienten mit bestimmten Erkrankungen (Trauma, Autoimmunerkrankung und Sepsis) Neutrophile hatten, die anders funktionierten als Patienten von gesunden Spendern5. In zukünftigen Forschungsstudien könnte unsere Plattform verwendet werden, um die Neutrophilenfunktion bei einer Vielzahl von Patientenpopulationen zu analysieren. Diese Plattform kann die komplexe Koordination des Neutrophilenschwärmens quantitativ analysieren. Zusätzliche Studien können durchgeführt werden, um Einblicke in die Neutrophilenfunktion einer bestimmten Patientenpopulation oder neutrophilen Reaktionen auf einen Krankheitserreger von Interesse zu geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwickelten eine Mikrostamping-Plattform, um einheitliche Arrays von Biopartikeln zu erzeugen, um den in vitro neutrophilen Schwärmen zu stimulieren. Die In-vitro-Natur unserer Plattform ermöglicht es uns, die Komplikationen zu umgehen, die mit In-vivo-Schwärmeexperimenten entstehen, nämlich die schlechte Fähigkeit, Mediatoren zu analysieren, die von schwärmenden Neutrophilen freigesetzt werden5. Darüber hinaus werden In-vivo-Modelle in der Regel bei Nagetieren11</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering und des Comprehensive Cancer Center an der Ohio State University unterstützt. Die in diesem Bericht vorgestellten Daten stammen aus Bildern, die mit Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) verarbeitet wurden, die auf der Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University, verfügbar sind. Diese Einrichtung wird zum Teil durch das Stipendium P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD, unterstützt.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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