Биочастицы Microarrays для хемотаксического и молекулярного анализа человека нейтрофил Роесь в пробирке
Summary
Этот протокол генерирует биочастицы микроаррей, которые обеспечивают пространственно контролируемых нейтрофилов роятся. Он обеспечивает легкий доступ к посредникам, которые нейтрофилы высвобождают во время миграции, и позволяет проводить количественный анализ изображений.
Abstract
Нейтрофил роятся совместно процесс, с помощью которого нейтрофилы запечатать сайт инфекции и содействовать реорганизации тканей. Рой классически изучался в vivo в животных моделях, показывающих характерные закономерности миграции клеток. Однако модели in vivo имеют ряд ограничений, в ключая межклеточные посредники, которые трудно доступны и анализируют, а также неспособность непосредственно анализировать нейтрофилы человека. Из-за этих ограничений, существует необходимость в in vitro платформы, которая изучает роятся с человеческими нейтрофилов амии и обеспечивает легкий доступ к молекулярным сигналам, генерируемым во время роя. Здесь многоступенчатый процесс микроштамповки используется для генерации микроаря биочастиц, который стимулирует рой, имитируя инфекцию in vivo. Биочастица microarray индуцирует нейтрофилов роиться в контролируемой и стабильной образом. На микроарере нейтрофилы увеличивают скорость и образуют стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. Кроме того, был проанализирован супернатант, генерируемый нейтрофиловами, и было обнаружено, что 16 белков были дифференциально выражены в течение роя. Эта платформа in vitro роя облегчает прямой анализ миграции нейтрофилов и высвобождения белка воспроизводимым, пространственно контролируемым образом.
Introduction
Нейтрофилы, наиболее распространенные белые кровяные клетки в крови1, приобретают внимание в качестве потенциальных диагностических и терапевтических целей2,3, потому что они могут быть вовлечены в различные медицинские условия, включая подагра4, сепсис3, травма5,рак1,7,8, и различные аутоиммунные заболевания5,9. Нейтрофил роятся многоступенчатый, жестко регулируется процесс со сложностью, что делает его особенно интересным фокусом исследования5,10,11. Во время роя, нейтрофилы изолируют участок воспаления от окружающих здоровыхтканей 5,10,11. Правильная регуляция нейтрофила роя имеет важное значение для содействия заживлению ран и в конечном счете, разрешение воспаления5,12. Нейтрофил роя в первую очередь изучался в vivo у грызунов12,13,14,15 и зебрафиш10,11,12,15 моделей. Тем не менее, характер этих моделей in vivo животных приводит к ограничениям5. Например, посредники, выпущенные нейтрофиловами во время роя, не так легко доступны для анализа5. Кроме того, Есть много потенциальных источников для данного посредника in vivo, так что эксперимент in vivo должен ввести генетический дефицит, чтобы ингибировать клеточного производства и / или взаимодействия для того, чтобы исследовать роль этого посредника в данном процессе13. Эксперимент in vitro обходит это осложнение, позволяя наблюдение за нейтрофилами без контекста дополнительных клеток. Кроме того, исследования, описывающие человека нейтрофил скоординированной миграцииограничено 16. На платформе витро роятся, человека нейтрофилов может быть непосредственно проанализированы. Платформа in vitro роя может расширить знания, полученные в результате исследований in vivo, предоставив возможности для заполнения пробелов, оставленных ограничениями исследований in vivo.
Для удовлетворения потребности в платформе in vitro, которая имитирует в ививо-нейтрофил роятся, мы разработали платформу микроштампов, которая позволяет нам узор биочастицы микроаррей, которые стимулируют нейтрофил роятся в пространственно контролируемым образом. Мы генерируем биочастицы микроаррей на стеклянных слайдах в двухэтапном процессе. Во-первых, мы используем микроштамповку для создания микроарра пятенного полиэлектролита (CP). Во-вторых, мы добавляем раствор биочастиц, которые придерживаются cp пятна через электростатическое взаимодействие. При первом узоре слое CP, мы можем выборочно шаблон отрицательно заряженных биочастиц для создания желаемого нейтрофила роя картины. Положительно заряженный слой удерживает отрицательно заряженные биочастицы через энергичную шаг стирки, которая удаляет биочастицы из областей на стеклянной горке, которые не имеют CP. Кроме того, CP используется здесь, кополимер акриламид и quaternized cationic мономер, является биосовместимым, так что это не вызывает реакцию от нейтрофилов. Он имеет очень высокий поверхностный заряд, который обездвиживает биочастицы размером с микрон к стеклянной горке, тем самым препятствуя нейтрофилу нейтрофилов удалять частицы из узорчатого положения на стеклянном слайде. Это приводит к биочастий кластеров, расположенных в microarray. Когда мы добавили нейтрофилов в микроаррей, они образовали стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. С помощью отслеживания миграции нейтрофилов мы обнаружили, что роятся нейтрофилы, активно мигрирующие в кластеры биочастиц. Кроме того, мы использовали эту платформу для анализа некоторых посредников, которые нейтрофилы высвобождают во время рояния. Мы нашли 16 посредников, которые дифферепрециально выражены во время роя. Их концентрации следуют трем общим тенденциям с течением времени: увеличение, уменьшение или всплеск. Наша платформа in vitro neutrophil swarming облегчает анализ пространственно контролируемого кишат нейтрофила, а также сбор и анализ посредников, выпущенных нейтрофилами. В предыдущей публикации, мы показали, что пациенты с определенными заболеваниями (травма, аутоиммунные заболевания и сепсис), были нейтрофилы, которые функционировали иначе, чем у здоровых доноров5. В будущих исследованиях, наша платформа может быть использована для анализа функции нейтрофилов среди различных популяций пациентов. Эта платформа может количественно проанализировать сложную координацию, связанную с нейтрофил роя. Дополнительные исследования могут быть сделаны, чтобы дать представление о нейтрофильной функции конкретной популяции пациентов или нейтрофил ответ на патоген, представляющий интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали платформу микроштамповки для генерации однородных массивов биочастиц для стимулирования роятся в пробирке нейтрофила. In vitro характер нашей платформы позволяет нам обойти осложнения, которые возникают с in vivo роятся эксперименты, а именно плохая способность анализирова?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием со стороны Уильяма Г. Лоури Департамента химической и биомолекулярной инженерии и Всеобъемлющего онкологического центра в Университете штата Огайо. Данные, представленные в этом докладе, были получены из изображений, обработанных с помощью Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane), доступных в Campus Microscopy and Imaging Facility, Университет штата Огайо. Этот объект поддерживается частично грантом P30 CA016058, Национальным институтом рака, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
