Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro
Summary
Questo protocollo genera microarray di bioparticelle che forniscono brulio di neutrofoni controllati spazialmente. Fornisce un facile accesso ai mediatori che i neutrofili rilasciano durante la migrazione e consente l’analisi quantitativa dell’imaging.
Abstract
Lo sciame neutrofilo è un processo cooperativo attraverso il quale i neutrofili sigillano un sito di infezione e promuovono la riorganizzazione dei tessuti. Lo sciame è stato studiato in modo classico in vivo in modelli animali che mostrano modelli caratteristici della migrazione cellulare. Tuttavia, i modelli in vivo hanno diverse limitazioni, tra cui mediatori intercellulari che sono difficili da accedere e analizzare, così come l’incapacità di analizzare direttamente i neutrofili umani. A causa di queste limitazioni, c’è bisogno di una piattaforma in vitro che studia brulicante di neutrofili umani e fornisce un facile accesso ai segnali molecolari generati durante lo sciame. Qui, un processo di microstampa multifase viene utilizzato per generare un microarray di bioparticelle che stimola lo sciame imitando un’infezione in vivo. Il microarray di bioparticelle induce i neutrofili a sciamare in modo controllato e stabile. Sul microarray, i neutrofili aumentano di velocità e formano sciami stabili intorno ai cluster di bioparticelle. Inoltre, è stato analizzato il supernatante generato dai neutrofili e si è scoperto che 16 proteine sono state espresse in modo differenziale nel corso dello sciame. Questa piattaforma di brulichi in vitro facilita l’analisi diretta della migrazione dei neutrofili e del rilascio di proteine in modo riproducibile e controllato dallo spazio.
Introduction
Neutrofili, il più abbondante globulo bianco nel flusso sanguigno1, stanno guadagnando l’attenzione come potenziali bersagli diagnostici e terapeutici2,3 perché possono essere coinvolti in una varietà di condizioni mediche tra cui gotta4, sepsi3, trauma5,6, cancro1,7,8, e varie malattie autoimmuni5,9. Lo sciame neutrofilo è un processo multifase, strettamente regolato con una complessità che lo rende un focus particolarmente interessante di studio5,10,11. Durante lo sciame, i neutrofili isolano un sito di infiammazione dal tessuto sano circostante5,10,11. Una corretta regolazione del brulicante di neutrofoni è essenziale per promuovere la guarigione delle ferite e, in ultima analisi, la risoluzione dell’infiammazione5,12. Lo sciame neutrofilo è stato studiato principalmente in vivo nel roditore12,13,14,15 e pesce zebra10,11,12,15 modelli. Tuttavia, la natura di questi modelli animali in vivo dà luogo a limitazioni5. Ad esempio, i mediatori rilasciati dai neutrofili durante lo sciame non sono facilmente accessibili per l’analisi5. Inoltre, ci sono molte fonti potenziali per un determinato mediatore in vivo, quindi un esperimento in vivo deve introdurre una carenza genetica per inibire la produzione cellulare e/o l’interazione al fine di studiare il ruolo di quel mediatore in un dato processo13. Un esperimento in vitro aggira questa complicazione consentendo l’osservazione dei neutrofili senza il contesto di cellule aggiuntive. Inoltre, la ricerca che descrive la migrazione coordinata dei neutrofili umani è limitatadi 16. Su una piattaforma di bruliè in vitro, i neutrofili umani possono essere analizzati direttamente. Una piattaforma di brulicante in vitro potrebbe ampliare le conoscenze acquisite dagli studi in vivo fornendo opportunità per colmare le lacune lasciate dai limiti degli studi in vivo.
Per rispondere alla necessità di una piattaforma in vitro che imita il brulicare di neutroni in vivo, abbiamo sviluppato una piattaforma di microstamping che ci permette di patternare microarray di bioparticelle che stimolano il brulicare di neutroni in modo controllato spazialmente. Noi generiamo microarray di bioparticelle su vetrini di vetro in un processo in due fasi. In primo luogo, utilizziamo il microstamping per generare un microarray di macchie di polielettrolita cationico (CP). In secondo luogo, aggiungiamo una soluzione di bioparticelle che aderiscono alle macchie CP tramite interazione elettrostatica. Modellando prima lo strato CP, possiamo modellizzare selettivamente bioparticelle caricate negativamente per generare il modello di brulicante di neutrofili desiderato. Lo strato caricato positivamente contiene le bioparticelle caricate negativamente attraverso la fase di lavaggio vigoroso che rimuove le bioparticelle dalle aree sul vetrino che non hanno il CP. Inoltre, il CP utilizzato qui, un copolimero di acrilammide e monomero cationico quaternizzato, è biocompatibile, quindi non induce una risposta dai neutrofili. Ha una carica superficiale molto alta che immobilizza le bioparticelle di dimensioni micron al vetrino di vetro, impedendo così ai neutrofili di rimuovere le particelle dalla posizione modellata sul vetrino di vetro. Ciò si traduce in cluster di bioparticelle disposti in un microarray. Quando abbiamo aggiunto i neutrofili al microarray, formavano sciami stabili intorno agli ammassi di bioparticelle. Attraverso il monitoraggio della migrazione dei neutrofili, abbiamo scoperto che i neutrofili brulicanti migrano attivamente verso i cluster di bioparticelle. Inoltre, abbiamo usato questa piattaforma per analizzare alcuni mediatori che i neutrofili rilasciano durante lo sciame. Abbiamo trovato 16 mediatori che sono espressi in modo differenziale durante lo sciame. Le loro concentrazioni seguono tre tendenze generali nel tempo: aumento, diminuzione o picco. La nostra piattaforma di brulichi neutrofili in vitro facilita l’analisi del brulicare di neutrofi umani controllato spazialmente, così come la raccolta e l’analisi di mediatori rilasciati da brulicanti di neutrofoni. In una pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che i pazienti con determinate condizioni mediche (trauma, malattia autoimmune e sepsi), avevano neutrofili che funzionavano in modo diverso rispetto a quelli provenienti da donatori sani5. In studi di ricerca futuri, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzata per analizzare la funzione neutrofila tra una varietà di popolazioni di pazienti. Questa piattaforma può analizzare quantitativamente la complessa coordinazione coinvolta nello sciame neutrofico. Ulteriori studi possono essere fatti per fornire informazioni sulla funzione neutrofila di una specifica popolazione di pazienti o la risposta dei neutrofili a un agente patogeno di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato una piattaforma di microstampa per generare array uniformi di bioparticelle per stimolare il brulicare di neutrofoni in vitro. La natura in vitro della nostra piattaforma ci permette di aggirare le complicazioni che sorgono con esperimenti di sciame in vivo, vale a dire la scarsa capacità di analizzare i mediatori rilasciati dai neutrofili brulicanti5. Inoltre, i modelli in vivo vengono in genere eseguiti in roditori11,12</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare William G. Lowrie e dell’Comprehensive Cancer Center presso la Ohio State University. I dati presentati in questo rapporto provengono da immagini elaborate utilizzando Imaris x64 (vers. 9.3.0 Bitplane) disponibili presso il Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Questa struttura è supportata in parte dalla concessione P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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