Summary
Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.
Abstract
Die Fähigkeit, die Lungenhistologie zu bewerten, ist entscheidend für die Bereiche Lungenkrebsforschung und Krebsmetastasierung. Ebenso wichtig ist es, Nekropsien schnell und effizient aus Studien durchzuführen, ohne die Qualität des beschafften Gewebes zu beeinträchtigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur schnellen Durchlässigkeit, Aufblasung und Fixierung von Mauslungen für die nachgelagerte histologische Analyse zu präsentieren. Diese Methode standardisiert die Lungeninflation nicht; daher erfordert es keine speziellen Verfahren oder Ausrüstung und stattdessen nur fixierend direkt durch die Luftröhre nach Perfusion durch das Herz. Dies ermöglicht eine ausreichende Schätzung der Tumorgröße, Histologie und Bewertung. Dies ermöglicht auch die Sammlung von gefrorenem Gewebe vor der Lungengewebefixierung. Diese Methode ist insofern eingeschränkt, als sie eine spätere morphometrische Quantifizierung der Lunge nicht zulässt; Es reicht jedoch mehr als aus für Lungentumoranalysen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs), syngene Modelle sowie Xenograft-Tumor- und Metastasenstudien.
Introduction
Eine Vielzahl von Mausmodellen der Lungenonkogenese und Krebsmetastasen in die Lunge gibt es von komplexen GEMMs über krebserregende Modelle bis hin zu syngenischen und Xenograft-Modellen, bei denen Krebszellen über intrakardiale, intrathorakale, die Schwanzvene oder andere Methoden zur Etablierung von Tumoren in der Lunge injiziert werden. Alle diese Modelle teilen die gemeinsame Notwendigkeit der histologischen Bewertung der Lungenhistologie und Pathologie. Daher ist es notwendig, eine robuste, aber schnelle Methode zu haben, um Nekropsien von Mäusen durchzuführen, während die Lunge durchsetzt wird, um überschüssiges Blut zu entfernen, und die Lunge aufzublasen und zu fixieren, um die Lungenarchitektur klar zu visualisieren. Geschwindigkeit ist ein kritischer Bestandteil dieses Verfahrens, da es notwendig sein kann, die Lunge von Dutzenden von Mäusen zu einem einzigen Zeitpunkt zu sammeln. Dieses Verfahren kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden.
Während dieses Verfahren mehr als ausreichend für die Bewertung der Tumorhistologie ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, die stereologische oder morphometrische Messungen der Lunge durchführen möchten. Solche Messungen erfordern eine Standardinflation der Lunge, ebenso wie die Berechnung der absoluten Oberfläche der Lunge, des absoluten Volumens und der Alveolargröße und der Zahl1. Diese Methode ist auch nicht optimal für einige bildgebende Ansätze. Zum Beispiel erfordert die Bildgebung der Lunge über die "CT" für die ex vivo morphometrische Analyse, dass die Lunge mit Luft gefüllt bleibt2. Wenn die Erhaltung von Lufträumen und Abmessungen das Hauptanliegen ist, wird empfohlen, die Lunge durch Perfusionsdehydrierungstechniken3,4zu fixieren. Eines der größten Anliegen dieses Modells ist das Potenzial für das Brechen der Alveolarwände, die seine Verwendung in Studien von Emphysem enden; Das empfohlene Verfahren zur Fixierung der Lunge zur Untersuchung von Emphysem ist jedoch noch recht ähnlich, da es empfohlen wird, die Lunge entweder durch intratracheale Instillation von 10% Formalin (ähnlich dem hier beschriebenen Protokoll) unter konstantem Flüssigkeitsdruck oder durch In-situ-Fixierung5zu fixieren.
Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht hier darin, dass es keinen konstanten Flüssigkeitsdruck erfordert, sondern die Lunge aufbläht, bis sie sich vollständig erweitert hat, wodurch die für das Verfahren benötigte Zeit verringert wird. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den Methoden, die von einem Rüstungsarium der Gesellschaft für Toxikologische Pathologie empfohlen werden, wo ein Unterausschuss gebildet wurde, um die besten Methoden der Lungenfixierung für toxikologische Studien zu empfehlen. Die Mehrheit der Wissenschaftler in diesem Unterausschuss empfahl, die Lunge durch intratracheale Instillation mit einer Spritze zu fixieren, obwohl es unterschiedliche Empfehlungen für die Zeit gab, zu der die Lunge imfixativen 6belassen wurde. Während es also eine Vielzahl von Methoden der Lungeninflation und -fixierung gibt, wird die hier beschriebene Methode als optimale Methode vorgeschlagen, um die Lunge schnell aufzublasen und für die nachgeschaltete tumorhistologische Bewertung zu fixieren.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Alabama in Birmingham genehmigt.
1. Experimentelles Protokoll
- Opfern Sie die Maus mit einer zugelassenen IACUC-Methode. Hier verwendeten wir zervikale Dislokation einer Maus mit 5% Isofluran anästhetisiert. Verwenden Sie eine geeignete Maus für die Studie; hier verwenden wir eine 8 Wochen alte FVB-Maus
- Mit chirurgischer Schere, machen Sie einen 3,5-5 mm horizontalen Schnitt in der Mitte des Unterbauchs. Als nächstes legen Sie chirurgische Schere in das kleine Loch aus Schnitt erstellt und schneiden vertikal die mittlere Mittellinie bis knapp unter dem Hals der Maus.
- Ziehen Sie die Haut mit den Fingern zurück und inspizieren Sie die axillären Lymphknoten.
- Mit chirurgischer Schere, machen Sie einen 3,5 mm seitlichen Schnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen, und schneiden Sie dann in vorderer Richtung bis zum Boden des Thorax. Inspizieren Sie die Organe in der Bauchhöhle: Leber, Milz, Nieren, etc.
- Mit der Flachen der chirurgischen Schere, oder mit Zangen, bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen. Prüfen Sie das Zwerchfell auf Tumorwachstum oder Metastasen. Schnipsen Sie dann vorsichtig die Membran auf der rechten Seite des Bedieners, so dass es sich ausdehnen kann. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig von rechts nach links, um die Brusthöhle und die Lunge freizulegen. Achten Sie darauf, die Lunge nicht zu schneiden.
- Schneiden Sie durch das seitliche Extrem des linken Rippenkäfigs (rechts) des Bedieners, um den linken Lappen der Lunge zu inspizieren.
- Bewegen Sie die rechten Lungenlappen vorsichtig aus dem Weg und schneiden Sie das seitliche Extrem des rechten Rippenkäfigs auf und entfernen Sie den Rippenkäfig.
HINWEIS: Die Entfernung des Rippenkäfigs ist optional, obwohl die Entfernung eine klarere Sicht auf die spätere Lungeninflation ermöglicht.- Wenn frisches oder gefrorenes Lungengewebe erforderlich ist, verwenden Sie Hämostatzangen, um den Bronchus des linken Lappens zu klemmen und die linke Lunge mit einer chirurgischen Schere vor der Perfusion zu resektieren.
- Mit der Zange, um das Gewebe zu heben, das die Luftröhre bedeckt, schneiden Sie überschüssiges Gewebe weg. Dann schneiden Sie vorsichtig das dünne Gewebe Auskleidung der Luftröhre, um die Atemwege auszusetzen.
- Schneiden Sie die Nierenarterie mit chirurgischer Schere durch.
- Um die Lunge zu durchdringen, verwenden Sie eine 3 ml Spritze mit einer 22 G Nadel, um 1x PBS mit 10 U/ml Heparin in die rechte Herzkammer zu injizieren. Durchdringen Sie die Lunge mit PBS/Heparin langsam bei ca. 300 l/s. Die Lunge wird häufig weiß. In diesem Schritt werden in der Regel 2,5 ml PBS verwendet.
- Für die Lungeninflation verwenden Sie eine 3 ml Spritze mit einer 22 G Nadel, diesmal parallel zur Luftröhre gehalten. Setzen Sie die Nadel in die Luftröhre ein und injizieren Sie 10% Formalin mit einer Durchflussrate von nicht mehr als 200 l/s, bis die Lunge vollständig aufgeblasen ist. Sobald die Lunge aufgeblasen ist, wird Formalin aus der Luftröhre zurückfließen. Halten Sie die Nadel noch ein paar Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie sich dann zurück.
- (Optional) Vor dem Zurückziehen der Nadel- und Lungeninflation verwenden Sie Nahtgewinde, um die Luftröhre abzubinden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie 4 Zoll Nahtgewinde halten den Punkt des Gewindes mit einem kleinen Paar Zangen. Legen Sie den Faden auf die Dorsalseite der Luftröhre und ziehen Sie durch, um eine Schleife um die Nadel zu machen. Als nächstes machen Sie einen Überhandknoten um die Nadel. Knoten fest ziehen, Nadel aus Luftröhre entfernen, Knoten schließen.
- Verwenden Sie Zangen, um das Herz zu heben, setzen Sie chirurgische Schere direkt hinter der Lunge, und schneiden Sie Bindegewebe, während das Herz angehoben, um die Lunge zu resektieren.
- Schneiden Sie das Herz, um es aus der Lunge zu entfernen.
- Legen Sie die Lunge eine Kassette mit der Maus-ID oder Studien-ID beschriftet. Legen Sie die Kassette in 10% gepuffertes Formalin und fixieren Sie für 24-48 h. Lungen können auf Wunsch über ein Jahr fixativ belassen werden.
- Übertragen Sie die Kassette mit der Lunge auf 70% Ethanol und gehen Sie mit der Verarbeitung für die Histologie.
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Representative Results
Das obige Protokoll ermöglicht eine schnelle Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen. Die nachstehenden Abbildungen stellen die Bedeutung jedes Schritts dar. Abbildung 1 zeigt H&E-gefärbte Lungen, die mit PBS und Lunge durchdrungen wurden, bei denen der Perfusionsschritt übersprungen wurde oder die Lunge nicht richtig durchdrang. Wie gezeigt, erzeugt überschüssiges Blut in der schlecht durchbluteten Lunge weniger als ideale Histologie und kann es schwierig machen, die Lungenarchitektur vollständig zu beobachten. Abbildung 2 zeigt sowohl die Bedeutung der Inflation als auch die Gefahren einer Überinflation. Es ist schwieriger, Bereiche der Hyperplasie in nicht aufgeblasenen Lungen aufgrund der Kompression und Nähe der Alveolen zu identifizieren; jedoch, in der überblähten Lunge, viele der AlveolarWände wurden gebrochen und dies könnte mit Emphysem verwechselt werden, wenn nicht vorsichtig. Abbildung 3 zeigt die Tumorhistologie in der Lunge, die mit der hier beschriebenen Technik durchdrungen und aufgeblasen wurden.
Abbildung 1: Repräsentative H&E-Färbung von durchbluteten und nicht durchbluteten Lungen. (A) Lunge durchsetzt mit PBS. (B) Lunge nicht durchlässig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative H&E-Färbung von aufgeblasenen, aufgeblasenen und überhöhten Lungen. (A) Die Lunge wurde aufgeblasen und mit 10 % Formalin fixiert, bis sich die Lunge vollständig ausdehnte. (B) Die Lunge wurde nicht durch die Luftröhre aufgeblasen und stattdessen direkt in 10% Formalin gelegt. (C) Die Lunge wurde aufgeblasen und mit 10 % Formalin fixiert, aber 10 % Formalin wurden nach einer vollständigen Expansion kontinuierlich in die Lunge geschoben, was zu einer Überinflation führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative H&E-Färbung von perfundierten und aufgeblasenen Mauslungen. (A) Lungentumoren wurden mit dem chemischen karzinogenen Urethan induziert. (B) Spontane Lungenmetastasen aus einer menschlichen xenografierten Zelllinie Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das oben beschriebene Verfahren zur Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen ist ideal für die schnelle und effiziente Vorbereitung der Mauslungen für die Lungentumorhistologie und Pathologieanalyse. Das Verfahren erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden. Das Verfahren erfordert weder ein festes Volumen für die Inflation noch einen konstanten Flüssigkeitsdruck. Da dieses Verfahren nicht standardisiert ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, die stereologische oder morphometrische Analysen der Lunge durchführen möchten. Verfahren, bei denen eine solche Standardisierung erforderlich ist, wurden besser beschrieben1,7.
Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind Perfusion und Inflation. Es ist wichtig, durch die rechte Herzkammer zu durchdringen, während, wenn Perfusion durch die linke Herzkammer durchgeführt wird, die Lunge nicht durchdringen wird. Es ist leicht zu sagen, ob die Durchblutung richtig durchgeführt wird, da die Lunge weiß wird. Die Instillation von Fixativ durch die Luftröhre ermöglicht eine Inflation der Lunge, was eine einfachere nachgelagerte histologische Analyse der Lungenarchitektur ermöglicht. Es ist wichtig, die Verabreichung von Fixiermitteln zu stoppen, sobald sich die Lunge vollständig erweitert hat, da eine Überinflation zu einem Bruch der Alveolarwand und dem Auftreten von Emphysemführen führen kann. Sobald die Lunge aufgeblasen ist, wird etwas Formalin aus der Luftröhre zurückfließen. Dies ist normal und wirkt sich nicht auf die nachgelagerte histologische Analyse aus; Wenn dies jedoch ein Problem ist, kann die Luftröhre vor dem Ausziehen der Lunge abgebunden werden.
Während dieses Protokoll 10% gepuffertes Formalin verwendet, um die Lunge zu fixieren, was die am häufigsten empfohlene fixative5,6ist, gibt es Berichte über Artefakte, die durch diese fixative eingeführt werden, nämlich Schrumpfung des Lungengewebes1,8. Wenn dies ein Problem ist, folgen Sie den Richtlinien der American Thoracic Society und der European Respiratory Society für die Beurteilung der Lungenstruktur1. Ein weiteres potenzielles Fixative nicht allgemein empfohlen, aber das kann sich als nützlich erweisen, ist Bouin Lösung, die einen besseren Kontrast für die Bewertung der Lungenoberfläche Knötchen9,10bieten kann. Zusammenfassend bietet das hier beschriebene Protokoll eine robuste und einfache Methode zur Fixierung der Mauslungen für die Tumorhistologie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Center for Advancing Translational Sciences unter der AuszeichnungUL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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