Acute leverschade bij ratten veroorzaken via Carbon Tetrachloride (CCl4)Blootstelling via een Orogastrische buis
Summary
Dit protocol beschrijft een gemeenschappelijke en haalbare methode voor het induceren van acute leverschade (ALI) via CCl4 blootstelling via een orogastrische buis. CCl4 blootstelling induceert ALI door de vorming van reactieve zuurstofsoorten tijdens de biotransformatie in de lever. Deze methode wordt gebruikt om de pathofysiologie van ALI te analyseren en verschillende hepatoprotectieve strategieën te onderzoeken.
Abstract
Acute leverschade (ALI) speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van leverfalen, dat wordt gekenmerkt door ernstige leverdisfunctie, waaronder complicaties zoals hepatische encefalopathie en verminderde eiwitsynthese. Geschikte diermodellen zijn van vitaal belang om het mechanisme en de pathofysiologie van ALI te testen en verschillende hepatoprotectiestrategieën te onderzoeken. Vanwege zijn vermogen om chemische transformaties uit te voeren, wordt koolstoftetrachloride (CCl4)op grote schaal gebruikt in de lever om ALI te induceren door de vorming van reactieve zuurstofsoorten. CCl4 blootstelling kan intraperitoneally worden uitgevoerd, door inademing, of via een nasogastrische of orogastrische buis. Hier beschrijven we een knaagdiermodel, waarbij ALI wordt geïnduceerd door CCl4-blootstelling via een orogastrische buis. Deze methode is goedkoop, gemakkelijk te uitgevoerd, en heeft een minimaal risico risico. Het model is zeer reproduceerbaar en kan op grote schaal worden gebruikt om de werkzaamheid van potentiële hepatoprotectieve strategieën te bepalen en markers van leverletsel te beoordelen.
Introduction
De frequentie van giftige beledigingen aan de lever, vooral als gevolg van alcohol- en drugsmisbruik, neemt toe. Acuut leverletsel (ALI) wordt geassocieerd met hoge sterftecijfers en heeft klinische problemen veroorzaakt1,2. Giftig letsel leidt tot dodelijke seinen trajecten in de lever, wat resulteert in hepatocyte apoptose, necrose, of pyroptose. ALI speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van leverfalen, dat wordt gekenmerkt door ernstige leverdisfunctie, waaronder complicaties zoals hepatische encefalopathie en verminderde eiwitsynthese3,4. Hoewel recent onderzoek onze kennis over de fysiologische en pathologische veranderingen bij leverfalen heeft vergroot, heeft het de pathomoleculaire kenmerken die de mechanismen van celdood beïnvloeden niet volledig verklaard. Bovendien zijn er momenteel geen medicijnen beschikbaar om de progressieve verslechtering van ALI-patiënten om te keren. Momenteel is de enige aanzienlijk effectieve behandeling levertransplantatie5,6.
Om het mechanisme en de pathofysiologie van ALI te onderzoeken en verschillende hepatoprotectiestrategieën te testen, worden verschillende diermodellen gebruikt om ALI te induceren. Een voorkeursdiermodel van ALI moet het pathologische proces van de ziekte nabootsen via een betrouwbare, gevalideerde, goedkope en gemakkelijk toe te passen methode. Voorbeelden van experimentele modellen zijn hepatotoxische middelen, chirurgische ingrepen zoals totale of gedeeltelijke hepatectomie, volledige of voorbijgaande devascularisatie, en infectieve procedures7,8,9. Bekende hepatotoxische stoffen zijn galactosamine, paracetamol, thioacetamide, azoxymethaan en CCl4. Van deze, CCl4 wordt veel gebruikt, hoewel het nog niet goed is gekenmerkt10,11,12,13.
CCl4 is een organische kleurloze vloeibare verbinding met een zoete geur en bijna geen ontvlambaarheid bij lagere temperaturen. Blootstelling aan hoge concentraties CCl4 kan schade aan het centrale zenuwstelsel veroorzaken, waaronder verslechtering van de lever en nieren. CCl4 induceert ALI door zijn biotransformatie in de lever, die reactieve zuurstofsoorten vormt. Dit gebeurt via het P450 cytochroomenzym 2E1, dat een actieve metaboliet vormt en resulteert in celschade door macromolecuulbinding, verbetering van lipideperoxidatie en verstoring van intracellulaire calciumhomeostase14. Daarnaast kan het CCl4 model worden gebruikt om de astrocyten te stimuleren op het niveau van RNA synthese15. Dit hepatotoxine is toegediend door de intraperitoneale, intraportal, orale en intragastrische routes16.
In dit protocol beschrijven we in detail CCl4-geïnduceerde ALI bij ratten via een orogastrische buis. Deze methode induceert robuuste en reproduceerbare ALI die kan worden gebruikt om de pathogenese van ALI te onderzoeken. De bepaling van de ernst van de leverziekte wordt gecontroleerd door meting van serumglutamaat-pyruvaattransaminase (GPT), glutamic oxaloacetische transaminase (GOT) enzymen en totale bilirubine (TB) evenals definitieve histologische diagnose door hematoxylinen en eosine (H&E) gekleurde leverweefsels. Blootstelling aan CCl4 via een intragastrische toegang zorgt voor een praktische, goedkope, minimaal invasieve methode met minimaal risicorisico.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol wordt CCl4 gebruikt als levertoxine om ALI bij ratten op te wekken. ALI wordt gekenmerkt door verlies van hepatische parenchyma en daaropvolgende dysregulatie van de metabolische en synthetische functies van de lever. Geneesmiddelen, virussen, toxines, auto-immuunziekten, metabole ziekten en vasculaire aandoeningen veroorzaken allemaal hepatocyte dood, en de daaropvolgende ontstekingsreactie draagt bij aan de pathogenese van ALI.
De eerste belediging van de lever lei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen dankbaar Bertha Delgado, afdeling Pathologie, Soroka Medical Center, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, voor haar hulp in het laboratorium en in de histologieanalyse.
Materials
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma – Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma – Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver “function” tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
