Induzieren akute Leberverletzung bei Ratten über Kohlenstofftetrachlorid (CCl4) Exposition durch eine orogastrische Röhre
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine gängige und praktikable Methode zur Induktion akuter Leberverletzungen (ALI) über cCl4 Exposition durch eine orogastrische Röhre. CCl4 Exposition induziert ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies während seiner Biotransformation in der Leber. Diese Methode wird verwendet, um die Pathophysiologie von ALI zu analysieren und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen.
Abstract
Akute Leberverletzung (ALI) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Leberversagen, die durch schwere Leberfunktionsstörungen einschließlich Komplikationen wie Leberenzephalopathie und beeinträchtigte Proteinsynthese gekennzeichnet ist. Geeignete Tiermodelle sind entscheidend, um den Mechanismus und die Pathophysiologie von ALI zu testen und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen. Aufgrund seiner Fähigkeit, chemische Transformationen durchzuführen, ist Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) weit verbreitet in der Leber verwendet, um ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies zu induzieren. CCl4 Exposition kann intraperitoneal, durch Inhalation oder durch eine nasogastrische oder orogastrische Röhre durchgeführt werden. Hier beschreiben wir ein Nagetiermodell, bei dem ALI durch CCl4-Exposition durch eine orogastrische Röhre induziert wird. Diese Methode ist kostengünstig, leicht durchzuführen und weist ein minimales Gefahrenrisiko auf. Das Modell ist sehr reproduzierbar und kann weit verbreitet verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller hepatoprotektive Strategien zu bestimmen und Marker von Leberschäden zu bewerten.
Introduction
Die Häufigkeit toxischer Beleidigungen der Leber, insbesondere aufgrund von Alkohol- und Drogenmissbrauch, nimmt zu. Akute Leberschäden (ALI) sind mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden und haben klinische Bedenken verursacht1,2. Toxische Verletzungen führen zu Todessignalbahnen in der Leber, was zu Hepatozytenapoptose, Nekrose oder Pyroptose führt. ALI spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Leberversagen, die durch schwere Leberfunktionsstörungen einschließlich Komplikationen wie Leberenzephalopathie und beeinträchtigte Proteinsynthese gekennzeichnet ist3,4. Obwohl die jüngsten Forschungen unser Wissen über die physiologischen und pathologischen Veränderungen, die leberversagen begleiten, erweitert haben, hat sie die pathomolekularen Merkmale, die die Mechanismen des Zelltodes beeinflussen, nicht vollständig erklärt. Darüber hinaus sind derzeit keine Medikamente verfügbar, um die fortschreitende Verschlechterung bei ALI-Patienten umzukehren. Derzeit ist die einzige signifikant wirksame Behandlung Lebertransplantation5,6.
Um den Mechanismus und die Pathophysiologie von ALI zu untersuchen und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu testen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet, um ALI zu induzieren. Ein bevorzugtes Tiermodell von ALI sollte den pathologischen Prozess der Krankheit über eine zuverlässige, validierte, kostengünstige und einfach anzuwendende Methode nachahmen. Beispiele für experimentelle Modelle sind hepatotoxische Wirkstoffe, chirurgische Eingriffe wie die vollständige oder partielle Hepatektomie, eine vollständige oder vorübergehende Dekonvaskularisation und infektiöse Verfahren7,8,9. Bekannte hepatotoxische Substanzen sind Galactosamin, Acetaminophen, Thioacetamimid, Azoxymethan und CCl4. Davon ist CCl4 weit verbreitet, obwohl es noch nicht gut charakterisiert ist10,11,12,13.
CCl4 ist eine organische farblose flüssige Verbindung mit einem süßen Geruch und fast keine Entflammbarkeit bei niedrigeren Temperaturen. Die Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CCl4 kann Schäden am zentralen Nervensystem verursachen, einschließlich einer Verschlechterung der Leber und der Nieren. CCl4 induziert ALI durch seine Biotransformation in der Leber, die reaktive Sauerstoffspezies bildet. Dies geschieht über das P450-Zytochrom-Enzym 2E1, das einen aktiven Metaboliten bildet und zu einer Zellschädigung durch Makromolekülbindung, Verbesserung der Lipidperoxidation und Störung der intrazellulären Calciumhomöostase14führt. Darüber hinaus kann das CCl4-Modell verwendet werden, um die Astrozyten auf der Ebene der RNA-Synthese15zu stimulieren. Dieses Hepatotoxin wurde von den intraperitonealen, intraportalen, oralen und intragastrischen Routen16verabreicht.
In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert CCl4-induziertes ALI bei Ratten über eine orogastrische Röhre. Diese Methode induziert robusteund reproduzierbare ALI, die verwendet werden kann, um die Pathogenese von ALI zu untersuchen. Die Bestimmung der Schwere der Lebererkrankung wird durch Messung von Serumglutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Glutamic Oxaloestik-Transaminase (GOT)-Enzymen und Bilirubin (TB) sowie der definitiven histologischen Diagnose durch Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Lebergeweben überwacht. Die Exposition gegenüber CCl4 durch einen intragastrischen Zugang ermöglicht eine praktische, kostengünstige, minimalinvasive Methode mit minimalem Risikorisiko.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll, CCl4 wird als Lebergift verwendet, um ALI bei Ratten zu induzieren. ALI ist gekennzeichnet durch den Verlust von Leberparenchym und anschließende Dysregulation der metabolischen und synthetischen Funktionen der Leber. Medikamente, Viren, Toxine, Autoimmunerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Gefäßerkrankungen induzieren den Lebertod, und die anschließende Entzündungsreaktion trägt zur Pathogenese von ALI bei.
Die anfängliche Beleidigung der Leber fü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Bertha Delgado, Abteilung für Pathologie, Soroka Medical Center, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Ben-Gurion Universität des Negev, für ihre Hilfe im Labor sowie in der Histologie-Analyse.
Materials
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma – Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma – Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver “function” tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
