Indusere akutt leverskade hos rotter via karbon tetrachloride (CCl4) Eksponering gjennom et orogastrisk rør
Summary
Denne protokollen beskriver en vanlig og gjennomførbar metode for å indusere akutt leverskade (ALI) via CCl4 eksponering gjennom et orogastrisk rør. CCl4 eksponering induserer ALI gjennom dannelsen av reaktive oksygenarter under biotransformasjon i leveren. Denne metoden brukes til å analysere patofysiologien til ALI og undersøke forskjellige hepatoprotektoriske strategier.
Abstract
Akutt leverskade (ALI) spiller en avgjørende rolle i utviklingen av leversvikt, som er preget av alvorlig leverdysfunksjon, inkludert komplikasjoner som hepatisk encefalopati og nedsatt proteinsyntese. Passende dyremodeller er avgjørende for å teste mekanismen og patofysiologien til ALI og undersøke ulike hepatoprotektoriske strategier. På grunn av sin evne til å utføre kjemiske transformasjoner, er karbontetrachlorid (CCl4) mye brukt i leveren for å indusere ALI gjennom dannelsen av reaktive oksygenarter. CCl4 eksponering kan utføres intraperitonealt, ved innånding, eller gjennom et nasogastrisk eller orogastrisk rør. Her beskriver vi en gnagermodell, der ALI induseres av CCl4 eksponering gjennom et orogastrisk rør. Denne metoden er billig, lett utført, og har minimal fare. Modellen er svært reproduserbar og kan brukes mye for å bestemme effekten av potensielle hepatoprotective strategier og vurdere markører for leverskade.
Introduction
Hyppigheten av giftige fornærmelser mot leveren, spesielt på grunn av alkohol og narkotikamisbruk, øker. Akutt leverskade (ALI) er forbundet med høy dødelighet og har forårsaket kliniske bekymringer1,2. Giftig skade fører til dødssignalveier i leveren, noe som resulterer i hepatocytt apoptose, nekrose eller pyroptose. ALI spiller en avgjørende rolle i utviklingen av leversvikt, som er preget av alvorlig leverdysfunksjon, inkludert komplikasjoner som hepatisk encefalopati og nedsatt proteinsyntese3,4. Selv om nyere forskning har økt vår kunnskap om de fysiologiske og patologiske forandringene som følger med leversvikt, har den ikke helt forklart de patogene egenskapene som påvirker mekanismene for celledød. Videre er ingen medisiner for tiden tilgjengeligfor å reversere den progressive forverringen hos ALI-pasienter. Foreløpig er den eneste signifikant effektive behandlingen levertransplantasjon5,6.
For å undersøke mekanismen og patofysiologien til ALI og for å teste forskjellige hepatoprotektoringsstrategier, brukes forskjellige dyremodeller til å indusere ALI. En foretrukket dyremodell av ALI bør etterligne den patologiske prosessen av sykdommen via en pålitelig, validert, billig og lett å bruke metode. Eksempler på eksperimentelle modeller inkluderer hepatotoksiske midler, kirurgiske prosedyrer som total eller delvis hepatectomy, fullstendig eller forbigående devaskularisering, og infeksiøs prosedyrer7,,8,9. Kjente hepatotoksiske stoffer inkluderer galaktosamin, paracetamol, tioacetamid, azoksysan og CCl4. Av disse er CCl4 mye brukt selv om det ennå ikke er godt karakterisert10,11,12,13.
CCl4 er en organisk fargeløs væskeforbindelse med en søt lukt og nesten ingen brennbarhet ved lavere temperaturer. Eksponering for høye konsentrasjoner av Cl4 kan forårsake skade på sentralnervesystemet, inkludert forverring av leveren og nyrene. CCl4 induserer ALI gjennom sin biotransformasjon i leveren, som danner reaktive oksygenarter. Dette skjer via P450 cytokromenzymet 2E1, danner en aktiv metabolitt og resulterer i celleskade ved makromolekylbinding, forbedring av lipidperoksidasjon og forstyrrelse av intracellulær kalsium homeostase14. I tillegg kan CCl4-modellen brukes til å stimulere astrocytter på nivået av RNA-syntese15. Dette hepatotoksin har blitt administrert av intraperitoneal, intraportal, orale og intragastriske ruter16.
I denne protokollen beskriver vi i detalj CCl4-indusert ALI hos rotter via et orogastrisk rør. Denne metoden induserer robust og reproduserbar ALI som kan brukes til å undersøke patogenesen til ALI. Bestemmelse av leversykdom alvorlighetsgrad overvåkes ved måling av serum glutamat-pyruvate transaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) enzymer og total bilirubin (TB) samt definitiv histologisk diagnose av hematoksyslin og eosin (H & E) farget levervev. Eksponering for CCl4 gjennom en intragastrisk tilgang gir en praktisk, billig, minimal invasiv metode med minimal fare.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen brukes CCl4 som levertoksin for å indusere ALI hos rotter. ALI er preget av tap av leverparenchyma og påfølgende dysregulering av leverens metabolske og syntetiske funksjoner. Legemidler, virus, toksiner, autoimmune sykdommer, metabolske sykdommer og vaskulære lidelser induserer alle hepatocytdød, og den påfølgende inflammatoriske responsen bidrar til patogenese av ALI.
Den første fornærmelse naven fører til cytokinproduksjon, chemokinfrigjøring og på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner takknemlig Bertha Delgado, Institutt for patologi, Soroka Medical Center, Fakultet for helsevitenskap, Ben-Gurion University of the Negev, for hennes hjelp i laboratoriet så vel som i histologianalysen.
Materials
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma – Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma – Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver “function” tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
