Mass Spectrometrie-Guided Genome Mining als Werkzeug zur Aufdeckung neuartiger Naturprodukte

Summary

Hier wird ein Massenspektrometrie-geführtes Genom-Mining-Protokoll erstellt und beschrieben. Es basiert auf Genomsequenzinformationen und LC-MS/MS-Analysen und zielt darauf ab, die Identifizierung von Molekülen aus komplexen mikrobiellen und pflanzlichen Extrakten zu erleichtern.

Abstract

Der chemische Raum, der von natürlichen Produkten bedeckt wird, ist immens und weithin unerkannt. Daher sind bequeme Methoden zur umfassenden Bewertung ihrer Funktionen in der Natur und potenziellen menschlichen Nutzen (z. B. für Anwendungen zur Arzneimittelentdeckung) wünschenswert. Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von Genom-Mining (GM) und molekularer Vernetzung (MN), zwei zeitgenössischen Ansätzen, die genclustercodierte Anmerkungen in der sequenziierten Gesamtheit des Genoms mit chemischen Struktursignaturen aus rohen metabolischen Extrakten abgleichen. Dies ist der erste Schritt zur Entdeckung neuer natürlicher Wesen. Diese Konzepte werden, wenn sie zusammen angewendet werden, hier als MS-geführter Genomabbau definiert. Bei dieser Methode sind die Hauptkomponenten zuvor (mit MN) gekennzeichnet, und strukturell verwandte neue Kandidaten werden mit Genomsequenzanmerkungen (mit GM) verknüpft. Die Kombination von GM und MN ist eine gewinnbringende Strategie, um neue Molekül-Rückgrate anzusprechen oder metabolische Profile zu ernten, um Analoga aus bereits bekannten Verbindungen zu identifizieren.

Introduction

Untersuchungen des Sekundärstoffwechsels bestehen häufig darin, Rohextrakte auf spezifische biologische Aktivitäten zu untersuchen, gefolgt von Reinigung, Identifizierung und Charakterisierung der Bestandteile aktiver Fraktionen. Dieser Prozess hat sich als effizient erwiesen und die Isolierung mehrerer chemischer Einheiten gefördert. Heutzutage wird dies jedoch als undurchführbar angesehen, vor allem aufgrund der hohen Wiederentdeckungsraten. Als die pharmazeutische Industrie revolutionierte, ohne die Rollen und Funktionen spezialisierter Metaboliten zu kennen, wurde ihre Identifizierung unter Laborbedingungen durchgeführt, die die Natur nicht genau darstellten¹. Heute gibt es ein besseres Verständnis von natürlichen Signaleinflüssen, Sekretion und das Vorhandensein der meisten Ziele bei nicht nachweisbar niedrigen Konzentrationen. Darüber hinaus wird die Regulierung des Prozesses der akademischen Gemeinschaft und der pharmazeutischen Industrie helfen, dieses Wissen zu nutzen. Es wird auch der Forschung zugute kommen, die die direkte Isolierung von Metaboliten im Zusammenhang mit stillen biosynthetischen Genclustern (BGCs)²betrifft.

In diesem Zusammenhang haben Fortschritte bei der genomischen Sequenzierung das Interesse an screening-Mikroorganismenmetaboliten erneut geweckt. Dies liegt daran, dass die Analyse der genomischen Informationen von nicht entdeckten biosynthetischen Clustern Gene aufdecken kann, die neuartige Verbindungen kodieren, die nicht beobachtet oder unter Laborbedingungen produziert werden. Viele mikrobielle ganze Genomprojekte oder Entwürfe sind heute verfügbar, und die Zahl wächst jedes Jahr, was massive Aussichten für die Entdeckung neuer bioaktiver Moleküle durch Genomabbau^3,4bietet.

Der Atlas der biosynthetischen Gencluster ist die derzeit größte Sammlung automatisch abgebauter Gencluster als Bestandteil der Integrated Microbial Genomes Platform des Joint Genome Institute (JGI IMG-ABC)². Zuletzt hat die Standardisierungsinitiative Minimum Information for Biosynthetic Gene Clusters (MIBiG) die manuelle Reannotation von BGCs gefördert und einen hochgradig kuratierten Referenzdatensatz 5 zur Verfügung^gestellt. Heutzutage stehen viele Werkzeuge zur Verfügung, um das rechnerische Mining genetischer Daten und deren Verbindung zu bekannten sekundären Metaboliten zu ermöglichen. Außerdem wurden verschiedene Strategien für den Zugang zu neuen bioaktiven Naturprodukten entwickelt (z. B. heterologe Expression, Zielgenlöschung, In-vitro-Rekonstitution, genomische Sequenz, isotopengeführtes Screening [genomisotopen Ansatz], Manipulation lokaler und globaler Regulierungsbehörden, resistenzzielbasierter Bergbau, kulturunabhängiger Bergbau und in jüngerer Zeit MS-geführte/code-Ansätze^{2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15}).

Genomabbau als einzigartige Strategie erfordert Anstrengungen, um eine einzelne oder kleine Gruppe von Molekülen zu kommentieren; So bleiben Lücken im Prozess, in denen neue Verbindungen für Isolation und Strukturaufklärung priorisiert werden. Im Prinzip zielen diese Ansätze nur auf einen biosynthetischen Pfad pro Experiment ab, was zu einer langsamen Entdeckungsrate führt. In diesem Sinne stellt die Verwendung von GM zusammen mit einem molekularen Vernetzungsansatz einen wichtigen Fortschritt für die Naturproduktforschung^{dar 14,15}.

Die Vielseitigkeit, Genauigkeit und hohe Empfindlichkeit der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) machen es zu einer guten Methode zur zusammengesetzten Identifizierung. Derzeit haben mehrere Plattformen Algorithmen und Software-Suiten für ungezielte Metabolomik^{16,17,18,19,20}investiert. Der Kern dieser Programme umfasst die Feature-Erkennung (Peak Picking)²¹ und die Spitzenausrichtung, die die Übereinstimmung identischer Features über einen Stapel von Samples und die Suche nach Mustern ermöglicht. MS-Muster-basierte Algorithmen^22,23 vergleichen charakteristische Fragmentierungsmuster und stimmen MS^{2-Ähnlichkeiten} überein, die molekulare Familien mit strukturellen Merkmalen erzeugen. Diese Merkmale können dann hervorgehoben und gebündelt werden, was die Fähigkeit verleiht, bekannte und unbekannte Moleküle aus einem komplexen biologischen Extrakt durch Tandem MS^2,24,25schnell zu entdecken. Daher ist Tandem MS eine vielseitige Methode, um strukturelle Informationen über mehrere Chemotypen zu erhalten, die in einer großen Datenmenge gleichzeitig enthalten sind.

Der Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)^{26-Algorithmus} verwendet die normalisierte Fragmentionen-Intensität, um multidimensionale Vektoren zu konstruieren, bei denen Ähnlichkeiten mit einer Kosinusfunktion verglichen werden. Die Beziehung zwischen verschiedenen übergeordneten Ionen wird in einer Diagrammdarstellung dargestellt, in der jede Fragmentierung als Knoten (Kreise) visualisiert wird und die Verwandtschaft jedes Knotens durch eine Kante (Linien) definiert wird. Die globale Visualisierung von Molekülen aus einer Hand wird als molekulares Netzwerk definiert. Strukturell divergierende Moleküle, die auf einzigartige Weise fragmentieren, bilden ihren eigenen spezifischen Cluster oder ihre eigene Konstellation, während sich verwandte Moleküle zusammenschließen. Clustering-Chemotypen ermöglichen die hypothetische Verbindung ähnlicher struktureller Merkmale mit ihren biosynthetischen Ursprüngen.

Die Kombination sowohl von Chemotyp-zu-Genotyp- als auch von Genotyp-zu-Chemotyp-Ansätzen ist eine starke Wirkung, wenn es darum geht, Bioinformatik-Verbindungen zwischen BGCs und ihren kleinen Molekülprodukten herzustellen²⁷. Daher ist MS-geführter Genomabbau eine schnelle Methode und eine strategie mit geringem Materialverbrauch, und es hilft, Elternionen und biosynthetische Wege zu überbrücken, die von WGS einer oder mehrerer Stämme unter verschiedenen metabolischen und ökologischen Bedingungen aufgedeckt wurden.

Der Workflow dieses Protokolls (Abbildung 1) besteht darin, WGS-Daten in eine biosynthetische Gencluster-Anmerkungsplattform wie antiSMASH^28,29,30einzuspeisen. Es hilft, die Vielfalt der Verbindungen und Klasse der Verbindungen durch das Genom kodiert zu schätzen. Es muss eine Strategie zur Zielart ierung eines biosynthetischen Genclusters angenommen werden, der für eine chemische Einheit von Interesse kodiert, und Kulturextrakte aus einem WildenStamm und/oder heterologen Stamm, der den BGC enthält, können analysiert werden, um clusterierte Ionen auf der Grundlage von Ähnlichkeiten mit GNPS^26,31zu erzeugen. Folglich ist es möglich, neue Moleküle zu identifizieren, die mit dem zielgerichteten BGC assoziiert werden und in der Datenbank nicht verfügbar sind (hauptsächlich unbekannte Analoga, manchmal in niedrigen Tistern produziert). Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass Benutzer zu diesen Plattformen beitragen können und dass die Verfügbarkeit von Bioinformatik und MS/MS-Daten rapide zunimmt, was zu einer ständigen Weiterentwicklung und Aktualisierung effektiver Rechenwerkzeuge und Algorithmen führt, um effiziente Verbindungen komplexer Extrakte mit Molekülen zu steuern.

Abbildung 1: Übersicht über den gesamten Workflow. Gezeigt wird eine Illustration der bioinformatischen, klonenden und molekularen Vernetzungsschritte, die im beschriebenen MS-geführten Genom-Mining-Ansatz zur Identifizierung neuer Metaboliten beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Protokoll beschreibt einen schnellen und effizienten Workflow, um Genom-Mining und molekulare Vernetzung als Ausgangspunkt für die Pipeline zur Entdeckung natürlicher Produkte zu kombinieren. Obwohl viele Anwendungen in der Lage sind, die Zusammensetzung und Verwandtheit von MS-detektierbaren Molekülen in einem Netzwerk zu visualisieren, werden hier mehrere verwendet, um strukturell ähnliche gruppierte Moleküle zu visualisieren. Mit dieser Strategie, neuartige Cyclodepsipeptid Produkte in metabolischen Extrakten von Streptomyces sp. CBMAI 2042 beobachtet werden erfolgreich identifiziert. Geleitet vom Genombergbau wird der gesamte biosynthetische Gencluster, der für Valinomycine kodiert, erkannt und in den Produzentenstamm Streptomyces coelicolor M1146 geklont. Schließlich korrelieren die von MS nachgewiesenen Moleküle nach einer MS-Muster-basierten molekularen Vernetzung mit BGCs, die für ihre Biogenese verantwortlich sind³².

Protocol

1. Genomabbau für biosynthetische Gencluster Führen Sie die gesamte Genomsequenzierung (WGS) als ersten Schritt zur Wahl eines biosynthetischen Genclusters (BCG) für den MS-geführten Genombergbau durch. Der gesamte Genomentwurf des Stammes von Interesse (Bakterien) kann durch Illumina MiSeq Technologie mit den folgenden mit hochwertigen genomischen DNA erhalten werden: Schrotflinte TruSeq PCR-Free Bibliothek Prep und Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.ANMERKUNG: Nach der…

Representative Results

Das Protokoll wurde erfolgreich anhand einer Kombination aus Genom-Mining, heterologer Expression und MS-geführten/Code-Ansätzen für den Zugriff auf neue spezialisierte Valinomycin-Analogmoleküle veranschaulicht. Der Genom-zu-Molekül-Workflow für das Ziel, Valinomycin (VLM), ist in Abbildung 8dargestellt. Streptomyces sp. CBMAI 2042 Entwurf Genom wurde in Silico analysiert, und der VLM-Gen-Cluster wurde dann identifiziert und auf einen heterologen Wirt übertragen. Heterologe …

Discussion

Der stärkste Vorteil dieses Protokolls ist seine Fähigkeit, metabolische Profile schnell zu dereplizieren und genomische Informationen mit MS-Daten zu überbrücken, um die Strukturen neuer Moleküle, insbesondere struktureller Analoga^2,aufzuklären. Auf der Grundlage genomischer Informationen können verschiedene natürliche Produkte- Chemotypen untersucht werden, wie Polyketide (PK), nichtribosomale Peptide (NRP) und glykosylierte Naturprodukte (BSP) sowie kryptische BGCs. Metamonomisches Scre…

Materials

Acetonitrile	Tedia	AA1120-048	HPLC grade
Agar	Oxoid	LP0011	NA
Apramycin	Sigma Aldrich	A2024	NA
Carbenicillin	Sigma Aldrich	C9231	NA
Centrifuge	Eppendorf	NA	5804
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C3175	NA
Column C18	Agilent Technologies	NA	ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin	Sigma Aldrich	K1377	NA
Manitol P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	NA	5418
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F548S	NA
Q-TOF mass spectrometer	Agilent technologies	NA	6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
Shaker/Incubator	Marconi	MA420	NA
Sodium Chloride	Synth	NA	P. A. – ACS
Soy extract	NA	NA	NA
Sucrose	Synth	NA	P. A. – ACS
Thermal Cycles	Eppendorf	NA	Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton	Sigma Aldrich	T8902	NA
Tryptone	Oxoid	LP0042	NA
Tryptone Soy Broth	Oxoid	CM0129	NA
UPLC	Agilent Technologies	NA	1290 Infinity LC System
Yeast extract	Oxoid	LP0021	NA