Mineração de genoma guiada por espectrometria em massa como ferramenta para descobrir novos produtos naturais

Summary

Um protocolo de mineração de genoma guiado por espectrometria em massa é estabelecido e descrito aqui. Baseia-se em informações de seqüência de genomas e análise sustal e tem como objetivo facilitar a identificação de moléculas de extratos microbianos e vegetais complexos.

Abstract

O espaço químico coberto por produtos naturais é imenso e amplamente não reconhecido. Portanto, são desejadas metodologias convenientes para realizar uma avaliação abrangente de suas funções na natureza e potenciais benefícios humanos (por exemplo, para aplicações de descoberta de medicamentos). Este protocolo descreve a combinação de mineração de genoma (GM) e rede molecular (MN), duas abordagens contemporâneas que combinam anotações codificadas por genes em sequenciamento de genoma inteiro com assinaturas de estrutura química a partir de extratos metabólicos brutos. Este é o primeiro passo para a descoberta de novas entidades naturais. Esses conceitos, quando aplicados em conjunto, são definidos aqui como mineração de genoma guiada por MS. Neste método, os principais componentes são previamente designados (usando MN), e novos candidatos estruturalmente relacionados estão associados a anotações de seqüência de genoma (usando GM). A combinação de GM e MN é uma estratégia lucrativa para atingir novos backbones de moléculas ou perfis metabólicos de colheita, a fim de identificar análogos de compostos já conhecidos.

Introduction

As investigações do metabolismo secundário consistem frequentemente na triagem de extratos brutos para atividades biológicas específicas seguidas de purificação, identificação e caracterização dos constituintes pertencentes a frações ativas. Esse processo tem se mostrado eficiente, promovendo o isolamento de diversas entidades químicas. No entanto, hoje em dia isso é visto como inviável, principalmente devido às altas taxas de redescoberta. Como a indústria farmacêutica revolucionou sem o conhecimento dos papéis e funções dos metabólitos especializados, sua identificação foi realizada em condições laboratoriais que não representavam com precisão a natureza¹. Hoje, há uma melhor compreensão das influências de sinalização natural, secreção e presença da maioria dos alvos em concentrações indetectavelmente baixas. Além disso, a regulamentação do processo ajudará a comunidade acadêmica e a indústria farmacêutica a aproveitar esse conhecimento. Também beneficiará pesquisas envolvendo o isolamento direto dos metabólitos relacionados a aglomerados genéticos biossintéticos silenciosos (BGCs)².

Nesse contexto, os avanços no sequenciamento genômico têm renovado o interesse em triagem de metabólitos de microrganismos. Isso porque a análise das informações genômicas de aglomerados biossintéticos descobertos pode revelar genes codificando novos compostos não observados ou produzidos em condições laboratoriais. Muitos projetos ou rascunhos de genoma sumidos microbianos estão disponíveis hoje, e o número está crescendo a cada ano, fornecendo perspectivas maciças para descobrir novas moléculas bioativas através da mineração de genomas^3,4.

O Atlas de Clusters Genéticos Biossintéticos é a maior coleção atual de aglomerados genéticos minerados automaticamente como um componente da Plataforma Integrada de Genomas Microbianos do Instituto De genoma conjunto (JGI IMG-ABC)². Mais recentemente, a Iniciativa de Padronização de Clusters Genéticos Biossintéticos (MIBiG) promoveu a renotação manual dos BGCs, fornecendo um conjunto de dados de referência altamente curado⁵. Atualmente, muitas ferramentas estão disponíveis para permitir a mineração computacional de dados genéticos e sua conexão com metabólitos secundários conhecidos. Estratégias diferentes também foram desenvolvidas para acessar novos produtos naturais bioativos (ou seja, expressão heteróloga, exclusão de genes alvo, reconstituição in vitro, seqüência genômica, triagem guiada por isótopos [abordagem genomisotópica], manipulação de reguladores locais e globais, mineração baseada em alvos de resistência, mineração independente de cultura e, mais recentemente, abordagens guiadas por MS/código^{2,6,7,8,9, 10,,11,,12,,13,,14,,15}).

A mineração do genoma como estratégia singular requer esforços para anotar um único ou pequeno grupo de moléculas; assim, permanecem lacunas no processo em que novos compostos são priorizados para isolamento e elucidação de estrutura. Em princípio, essas abordagens visam apenas uma via biossintética por experimento, resultando assim em uma lenta taxa de descoberta. Nesse sentido, o uso da GM juntamente com uma abordagem de rede molecular representa um importante avanço para a pesquisa de produtos naturais^14,15.

A versatilidade, a precisão e a alta sensibilidade da espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS) fazem dele um bom método para identificação composta. Atualmente, várias plataformas têm investido algoritmos e suítes de software para metabolômicas não direcionadas^{16,,17,,18,,19,,20}. O núcleo desses programas inclui detecção de recursos (captação de pico)²¹ e alinhamento de pico, que permite a correspondência de características idênticas em um lote de amostras e a busca de padrões. Algoritmos baseados em padrões de MS^22,23 comparam padrões de fragmentação característicos e combinam semelhanças ms² gerando famílias moleculares compartilhando características estruturais. Essas características podem então ser destacadas e agrupadas, conferindo a capacidade de descobrir rapidamente moléculas conhecidas e desconhecidas a partir de um complexo extrato biológico por tandem MS^2,24,25. Portanto, tandem MS é um método versátil para obter informações estruturais de vários quimiotipos contidos em uma grande quantidade de dados simultaneamente.

O algoritmo Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)²⁶ usa a intensidade de íons fragmentos normalizados para construir vetores multidimensionais, nos quais as semelhanças são comparadas usando uma função cossena. A relação entre diferentes íons-pais é plotada em uma representação de diagrama, na qual cada fragmentação é visualizada como um nó (círculos), e a relação de cada nó é definida por uma borda (linhas). A visualização global de moléculas de uma única fonte é definida como uma rede molecular. Moléculas estruturalmente divergentes que se fragmentam exclusivamente formarão seu próprio aglomerado ou constelação específico, enquanto moléculas relacionadas se agrupam. O agrupamento de quimiotipos permite a conexão hipotética de características estruturais semelhantes às suas origens biossintéticas.

A combinação tanto do quimiotipo ao genótipo quanto das abordagens genótipo-quimiotipo é poderosa ao criar ligações bioinformática entre os BGCs e seus produtos de pequenas moléculas²⁷. Portanto, a mineração de genoma guiada por ESM é um método rápido e uma estratégia de baixo consumo de material, e ajuda a ponte de íons-mãe e vias biossintéticas reveladas pelo WGS de uma ou mais cepas diversas condições metabólicas e ambientais.

O fluxo de trabalho deste protocolo (Figura 1) consiste em alimentar dados WGS em uma plataforma de anotação de cluster genético biossintético, como antiSMASH^28,,29,,30. Ajuda a estimar a variedade de compostos e classe de compostos codificados pelo genoma. Uma estratégia para atingir um aglomerado genético biossintético codificando uma entidade química de interesse deve ser adotada, e extratos de cultura de uma cepa de tipo selvagem e/ou cepa heteróloga contendo o BGC podem ser analisados para gerar íons agrupados com base em semelhanças usando GNPS^26,31. Consequentemente, é possível identificar novas moléculas que se associam ao BGC direcionado e não estão disponíveis no banco de dados (principalmente análogos desconhecidos, às vezes produzidos em títulos baixos). É relevante considerar que os usuários podem contribuir para essas plataformas e que a disponibilidade de dados de bioinformática e MS/MS está aumentando rapidamente, levando a um constante desenvolvimento e atualização de ferramentas e algoritmos computacionais eficazes para orientar conexões eficientes de extratos complexos com moléculas.

Figura 1: Visão geral de todo o fluxo de trabalho. Mostrada é uma ilustração das etapas bioinformática, clonagem e rede molecular envolvidas na abordagem descrita de mineração de genoma sustal para identificar novos metabólitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho rápido e eficiente para combinar mineração de genoma e rede molecular como ponto de partida para o pipeline de descoberta de produtos naturais. Embora muitas aplicações sejam capazes de visualizar a composição e a relação de moléculas detectáveis em MS em uma rede, várias são adotadas aqui para visualizar moléculas agrupadas estruturalmente semelhantes. Utilizando essa estratégia, novos produtos de ciclodepsipeptídeos observados em extratos metabólicos de Estreptomices sp. CBMAI 2042 são identificados com sucesso. Guiado pela mineração do genoma, toda a codificação de aglomerados genéticos biossintéticos para valinomicinas é reconhecida e clonada na cepa produtora Streptomyces coelicolor M1146. Finalmente, seguindo uma rede molecular baseada em padrão de MS, as moléculas detectadas por MS estão correlacionadas com os BGCs responsáveis por sua biogênese³².

Protocol

1. Mineração de genoma para aglomerados genéticos biossintéticos Realizar o sequenciamento de genomainteiro (WGS) como o primeiro passo para eleger um cluster genético biossintético (BCG) para a mineração de genoma suscitado por MS. Todo o esboço de genoma da cepa de interesse (bactérias) pode ser obtido pela tecnologia Illumina MiSeq usando o seguinte com DNA genômico de alta qualidade: shotgun TruSeq PCR-Free library prep e Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.NOT…

Representative Results

O protocolo foi exemplificado com sucesso usando uma combinação de mineração de genoma, expressão heteróloga e abordagens guiadas por MS/código para acessar novas moléculas análogas especializadas de valinomicina. O fluxo de trabalho genoma-molécula para o alvo, valinomicina (VLM), está representado na Figura 8. Estreptomices sp. CBMAI 2042 foram analisados em sílico, e o aglomerado genético VLM foi então identificado e transferido para um hospedeiro heterólogo. Cepas…

Discussion

A maior vantagem deste protocolo é sua capacidade de dispor rapidamente perfis metabólicos e unir informações genômicas com dados de MS, a fim de elucidar as estruturas de novas moléculas, especialmente análogos estruturais². Com base em informações genômicas, diferentes quimiotipos de produtos naturais podem ser investigados, como poliketidas (PK), peptídeos não ribossômicos (NRP) e produtos naturais glicosilados (GNP), bem como BGCs enigmáticos. A triagem metabolômica produz evid?…

Materials

Acetonitrile	Tedia	AA1120-048	HPLC grade
Agar	Oxoid	LP0011	NA
Apramycin	Sigma Aldrich	A2024	NA
Carbenicillin	Sigma Aldrich	C9231	NA
Centrifuge	Eppendorf	NA	5804
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C3175	NA
Column C18	Agilent Technologies	NA	ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin	Sigma Aldrich	K1377	NA
Manitol P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	NA	5418
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F548S	NA
Q-TOF mass spectrometer	Agilent technologies	NA	6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
Shaker/Incubator	Marconi	MA420	NA
Sodium Chloride	Synth	NA	P. A. – ACS
Soy extract	NA	NA	NA
Sucrose	Synth	NA	P. A. – ACS
Thermal Cycles	Eppendorf	NA	Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton	Sigma Aldrich	T8902	NA
Tryptone	Oxoid	LP0042	NA
Tryptone Soy Broth	Oxoid	CM0129	NA
UPLC	Agilent Technologies	NA	1290 Infinity LC System
Yeast extract	Oxoid	LP0021	NA