باستخدام متعدد الطبقات Hydrogel Bioink في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لتوزيع الخلايا المتجانسة
Summary
هنا ، وضعنا استراتيجية معدلة متعددة الطبقات جديدة للبيوين السائل الشبيه (الجيلاتين ميثاكريلويل مع لزوجة منخفضة) لمنع ترسب الخلايا المغلفة.
Abstract
خلال عملية البثق ثلاثي الأبعاد، يمكن للبيوينكات الشبيهة بالسائل ذات اللزوجة المنخفضة حماية الخلايا من تلف الغشاء الناجم عن إجهاد القص وتحسين بقاء الخلايا المغلفة. غير أن الترسيب السريع للخلايا التي تحركها الجاذبية في الخزان يمكن أن يؤدي إلى توزيع الخلايا غير المتجذّر في الهياكل المطبوعة بيولوجياً، وبالتالي يعوق تطبيق البيوين السائلة الشبيهة بالسائل. هنا، وضعنا استراتيجية معدلة متعددة الطبقات جديدة للبيوين السائل مثل (على سبيل المثال، الجيلاتين الميثاكريل مع اللزوجة المنخفضة) لمنع ترسب الخلايا المغلفة. تم التلاعب بالواجهات السائلة المتعددة في البيوفينك متعدد الطبقات لتوفير الاحتفاظ بين الوجهين. ونتيجة لذلك، فإن عمل ترسيب الخلايا الذي يمر عبر الطبقات المجاورة في النظام متعدد الطبقات كان متخلفاً في خزان بيوينك. ووجد أن الاحتفاظ بين الوجهين أعلى بكثير من السحب الرسوبي للخلايا، مما يدل على الدور الحاسم للاستبقاء بين الوجهين في منع ترسب الخلايا وتعزيز تشتت أكثر تجانساً للخلايا في البيوين المتعدد الطبقات.
Introduction
ثلاثي الأبعاد (3D) الطباعة البيولوجية كانت طريقة واعدة لتصنيع النسخ المتماثلة المعمارية والوظيفية المعقدة من الأنسجة الأصلية في الطب الحيوي والتجدد1،2،3. الاستراتيجيات المشتركة للطباعة الحيوية ، بما في ذلك النافثة للحبر ، والبثق ، والطباعة stereolithography ، لديها إيجابيات وسلبيات من وجهات نظر مختلفة4. ومن بين هذه التقنيات، يتم استخدام إجراء البثق الأكثر شيوعًا بسبب فعاليته من حيث التكلفة. Bioink يلعب دورا رئيسيا في استقرار عملية البثق البيولوجية. وينبغي أن bioink الخلية محملة مثالية لا يكون فقط مواكبا بيولوجيا ولكن أيضا أن تكون مناسبة للخصائص الميكانيكية5. وعادة ما يتم تقديم Bioinks مع انخفاض اللزوجة على أنها حالة تشبه السائل. ويمكن أن تكون هذه bioinks بسهولة وبسرعة المودعة وتجنب تلف غشاء الخلية الناجمة عن ارتفاع الإجهاد القص أثناء البثق. ومع ذلك ، في الحالات المعقدة التي تتطلب فترات الطباعة الطويلة الأجل ، فإن انخفاض اللزوجة غالبا ما يؤدي إلى الترسيب الحتمي للخلايا المغلفة في خزان bioink ، والذي عادة ما تحركه الجاذبية ويؤدي إلى تشتت الخلايا غير المتهوّن في bioink6،7. وبالتالي، bioink مع تشتت الخلايا غير متجانسة يعوق في المختبر الحيوي بناء الأنسجة الوظيفية.
وقد أفادت عدة دراسات حديثة تركز على الأحياء الحيوية تعزيز التشتت المتجانس للخلايا المغلفة. وقد استخدم في البثق البيولوجي8من البثق البينات المعدلة على أساس الربط المتقاطع المزدوج. تم تعديل البوليمر alginate مع الببتيدات والبروتينات في هذه الدراسة. قدمت الخلايا توزيعًا أكثر تجانسًا في هذا الجينات المعدلة مما كانت عليه في الجينات الشائعة الاستخدام بسبب مواقع المرفقات التي توفرها الببتيدات والبروتينات. وبدلاً من ذلك، تم استخدام البيوينك المخلوطة لحل ترسبات الخلايا في بيوينك. تم استخدام بيوينك المخلوطة التي تحتوي على البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والجيلاتين أو الجيلاتين ميثاكريلوفيل (GelMA) مع تحسين متانة الميكانيكية في دراسة أخرى9. وقدمت الخلايا المغلفة توزيعا متجانسا أساسا لأن لزوجة بيونك المخلوطة قد تحسنت. بشكل عام ، هناك عدة عوامل تؤثر على تشتت الخلايا المغلفة في bioink ، مثل لزوجة بيوينك ، وجاذبية الخلايا ، وكثافة الخلايا ، ومدة فترة العمل. ومن بين هذه العوامل، تلعب جاذبية الخلايا دوراً حاسماً في تعزيز الترسيب. وقد تم التحقيق في الطفو والاحتكاك التي تقدمها bioink لزجة باعتبارها القوى الرئيسية ضد الجاذبية حتى الآن10.
هنا، وضعنا استراتيجية جديدة لتعزيز التشتت متجانسة للخلايا المغلفة في bioink عن طريق التلاعب واجهات سائلة متعددة في خزان بيوينك. هذه الواجهات السائلة التي تم إنشاؤها بواسطة التعديل متعدد الطبقات من bioink لا يمكن أن توفر فقط الاحتفاظ بين الوجهين ، مما يؤخر ترسب الخلايا ، ولكن أيضا الحفاظ على التوافق الحيوي والسلوك الريولوجي مناسب من bioink. في الممارسة العملية، قمنا بتعديل محلول GelMA مائي (5٪، ث / الخامس) مع الليفي الحرير (SF) بطريقة متعددة الطبقات لإنتاج طوليا أربعة واجهات، وتوفير التوترات بين الوجهين في bioink المخلوطة. ونتيجة لذلك، تم تعويض تحميل الجاذبية على الخلايا من خلال التوتر بين الوجهين من صنع الإنسان، وتم الحصول على تشتت متجانس تقريبا للخلايا المغلفة في بيوينك بسبب انخفاض الترسيب عبر الطبقات المجاورة من الخلايا. ولم يبلغ حتى الآن عن أي بروتوكول مماثل لإبطاء ترسب الخلايا المغلفة عن طريق التلاعب في الاحتفاظ بالتشوهات في البيوinkس السائلة. نقدم بروتوكولنا هنا لنوضح طريقة جديدة لحل ترسب الخلايا في الطباعة الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
استقرار النظام متعدد الطبقات هو نقطة رئيسية لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. قمنا نظرياً بحساب انتشار جزيئات SF في محلول GelMA بناءً على دراسة نعمان13. ووجد أن انتشار البروتينات في الحل يرتبط بوزنها الجزيئي. متوسط الوزن الجزيئي (MW) من الألبومين المصل البقري (BSA) هو 66.5 كيلو Da، ومعامل انت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81771971، 81970442، 81703470 و81570422)، برنامج البحث والتطوير الوطني الرئيسي في الصين (2018YFC1005002)، لجنة العلوم والتكنولوجيا لبلدية شنغهاي (17 مشروع JC1400200، مشروع شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (منحة رقم 2017SHZZX01)، ولجنة التعليم البلدي في شنغهاي (برنامج الابتكار 2017-01-07 -00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
