Homojen Hücre Dağılımı için Üç Boyutlu Biyobaskıda Çok Katmanlı Hidrojel Bioink'in Kullanılması
Summary
Burada, kapsüllü hücrelerin sedimantasyonunu önlemek için sıvı benzeri biyoinkler (düşük viskoziteli jelatin metakrilopil) için çok katmanlı modifiye edilmiş yeni bir strateji geliştirdik.
Abstract
Ekstrüzyon tabanlı üç boyutlu biyobaskı işlemi sırasında, düşük viskoziteli sıvı benzeri biyoinks, kesme stresinin neden olduğu membran hasarından hücreleri koruyabilir ve kapsüllenmiş hücrelerin hayatta kalmasını artırabilir. Ancak, rezervuarhızlı yerçekimi güdümlü hücre sedimantasyonu biyoprinted yapılarda homojen bir hücre dağılımına yol açabilir ve bu nedenle sıvı benzeri bioinks uygulanmasını engelleyebilir. Burada, kapsüllü hücrelerin sedimantasyonunu önlemek için sıvı benzeri biyoinkler (örn. düşük viskoziteli jelatin metakriloyl) için çok katmanlı yeni bir modifiye strateji geliştirdik. Çok katmanlı bioink’te birden fazla sıvı arabirimi, yüzler arası tutma sağlamak için manipüle edildi. Sonuç olarak, çok katmanlı sistemde bitişik tabakalar arasında giden hücre sedimantasyon eylem bioink rezervuar oldu. İnterasiyal retansiyonun hücrelerin tortul çekiminden çok daha yüksek olduğu, hücre sedimantasyonunu önlemede ve çok katmanlı biyoinkteki hücrelerin daha homojen bir şekilde dağılımını teşvik etmede interfacial tutmanın kritik bir rolünü gösterdiği saptandı.
Introduction
Üç boyutlu (3D) biyobaskı biyofabrikasyon ve rejeneratif tıp1,2,,3yerli dokuların karmaşık mimari ve fonksiyonel kopyaları üretmek için umut verici bir yöntem olmuştur. Mürekkep püskürtmeli, ekstrüzyon ve stereolitografi baskı dahil olmak üzere biyobaskı ortak stratejileri, farklı bakış açılarından artıları ve eksileri var4. Bu teknikler arasında, ekstrüzyon prosedürü en yaygın maliyet etkinliği nedeniyle kullanılır. Bioink ekstrüzyon biyobaskı süreci istikrar önemli bir rol oynar. İdeal hücre yüklü bioink sadece biyouyumlu değil, aynı zamanda mekaniközellikleri5 için uygun olmalıdır. Düşük viskoziteli bioinks genellikle sıvı benzeri bir durum olarak sunulmaktadır. Bu bioinks kolayca ve hızlı bir şekilde birikmiş ve ekstrüzyon sırasında yüksek kesme stresi tarafından indüklenen hücre zarı hasarı önlemek. Ancak, uzun süreli baskı süreleri gerektiren karmaşık durumlarda, düşük viskozite genellikle genellikle yerçekimi tarafından tahrik edilir ve bioink bir homojen hücre dağılımı yol açan bioink rezervuar kapsüllenmiş hücrelerin kaçınılmaz sedimantasyon yol açar6,7. Sonuç olarak, homojen hücre dağılımı ile bir biyoink fonksiyonel doku yapısı in vitro biyobaskı engeller.
Bioinks odaklanan birkaç yeni çalışmalar kapsüllenmiş hücrelerin homojen dağılım teşvik bildirdin. Modifiye aljinit biyoink çift kademeli crosslinking dayalı ekstrüzyon biyobaskı için kullanılmıştır8. Bu çalışmada bir aljinat polimeri peptidler ve proteinler ile modifiye edilmiştir. Hücreler bu modifiye aljinatta, peptidler ve proteinler tarafından sağlanan ek bölgeler eki nedeniyle yaygın olarak kullanılan aljinattan daha homojen bir dağılım sundular. Alternatif olarak, harmanlanmış bioinks bioink hücrelerin sedimantasyon çözmek için kullanılmıştır. Polietilen glikol (PEG) ve jelatin veya jelatin metakroril (GelMA) içeren bir karışım lı biyoink geliştirilmiş mekanik sağlamlık ile başka bir çalışmada kullanılmıştır9. Kapsüllü hücreler homojen bir dağılım sunduçünkü harmanlanmış biyoink’in viskozitesi daha iyi gelişti. Genel olarak, biyoink viskozitesi, hücrelerin yerçekimi, hücrelerin yoğunluğu ve çalışma süresi gibi biyoink kapsüllenmiş hücrelerin dağılımını etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bu faktörler arasında, hücrelerin yerçekimi sedimantasyon teşvik kritik bir rol oynar. Viskoz bioink tarafından sağlanan yüzdürme ve sürtünme bugüne kadar yerçekimine karşı ana kuvvetler olarak araştırılmıştır10.
Burada, bioink rezervuarındaki birden fazla sıvı arabirimini manipüle ederek kapsüllenmiş hücrelerin biyoinkteki homojen dağılımını teşvik etmek için yeni bir strateji geliştirdik. Bioink’in çok katmanlı modifikasyonu ile oluşturulan bu sıvı arayüzler sadece hücrelerin sedimantasyonunu geciktiren interfacial retansiyonu sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda biyoink’in uygun biyouyumluluğunu ve reolojik davranışını da sürdürebilir. Uygulamada, sulu GelMA çözeltisini (%5, w/v) ipek fibroin (SF) ile çok katmanlı bir şekilde uzunlamasına dört arayüz üreterek harmanlanmış bioinkte yüzler arası gerilimler sağladık. Sonuç olarak, hücrelere yüklenen yerçekimi insan yapımı interfacial tension ile dengelendi ve biyoink içinde kapsüllenmiş hücrelerin neredeyse homojen dağılım hücrelerin komşu katmanları arasında daha az sedimantasyon nedeniyle elde edildi. Bugüne kadar sıvı biyoinklerde interfacial retansiyonu manipüle ederek kapsüllenmiş hücrelerin sedimantasyonunu yavaşlatacak benzer bir protokol bildirilmemiştir. Biyobaskıda hücre sedimantasyonunu çözmenin yeni bir yolunu göstermek için protokolümüzü burada sıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok katmanlı sistemin kararlılığı, bu protokolü başarıyla gerçekleştirmek için önemli bir noktadır. Teorik olarak GelMA çözeltisindeki SF moleküllerinin difüzyonunu Nauman’ın13çalışmasına dayanarak hesapladık. Çözeltideki proteinlerin difüzyonunun molekül ağırlıklarıyla ilişkili olduğu bulunmuştur. Büyükbaş hayvan serum albumininin (MW) ortalama molekül ağırlığı (MW) 66.5 kDa olup difüzyon2katsayısı 64-72 m 2/s’dir. Fibrinojenin ortalama MW…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81771971, 81970442, 81703470 ve 81570422), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1005002), Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (17JC1400200), Şangay Belediye Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi (Hibe Hibe) hibe kabul. 2017SHZDZX01) ve Şangay Belediye Eğitim Komisyonu (İnovasyon Programı 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
