均質な細胞分布のための三次元バイオプリンティングにおける多層ヒドロゲルバイオインクの使用
Summary
ここでは、封入細胞の沈沈を防ぐために、液体状バイオインク(低粘度のゼラチンメタクリロイル)に対する新しい多層改変戦略を開発しました。
Abstract
押出ベースの3次元バイオプリンティングプロセス中に、低粘度の液体状のバイオインクは、剪断応力によって誘発される膜損傷から細胞を保護し、封入された細胞の生存を改善することができます。しかし、貯水池の急速な重力駆動細胞沈下は、バイオプリント構造における不均一な細胞分布を引き起こし、したがって液体のようなバイオインクの適用を妨げる可能性がある。ここでは、封入細胞の沈沈を防止するために、液体状バイオインク(例えば、低粘度のゼラチンメタクリロイル)に対する新しい多層改変戦略を開発しました。多層バイオインクで複数の液体界面を操作し、界面保持を提供した。その結果、多層系の隣接する層を横切る細胞沈め作用は、バイオインク貯留層において遅滞した。界面保持率は細胞の堆積物プルよりもはるかに高く、細胞沈沈を予防し、多層バイオインクにおける細胞のより均質な分散を促進する界面保持の重要な役割を示すことがわかった。
Introduction
三次元(3D)バイオプリンティングは、バイオファブリケーションと再生医療11、2、32,3におけるネイティブ組織の複雑な建築および機能的レプリカを製造する有望な方法である。インクジェット、押出し、立体撮影印刷を含むバイオプリンティングの一般的な戦略は、異なる視点から見た長所と短所を持っています4.これらの技術の中で、押し出し手順は、その費用対効果のために最も一般的に使用されます。バイオインクは、押出バイオプリンティングのプロセス安定性において重要な役割を果たしています。理想的な細胞を含むバイオインクは生体適合性であるだけでなく、機械的特性5にも適しているべきである。低粘度のバイオインクは、典型的には液体状の状態として提示される。これらのバイオインクは容易かつ迅速に堆積し、押出の間に高いせん断応力によって誘発される細胞膜損傷を避けることができる。しかし、長期印刷期間を要する複雑な場合には、低粘度がしばしば、生体インク貯蔵所内のカプセル化された細胞の沈下を起こし、これは通常重力によって駆動され、バイオインク66,77における不均一な細胞分散を引き起こします。その結果、不均一な細胞分散性を有するバイオインクは、機能的組織構築物のインビトロバイオプリンティングを妨げる。
バイオインクに焦点を当てたいくつかの最近の研究は、カプセル化された細胞の均質な分散性の促進を報告しています。.二重段架橋に基づく修飾アルギン酸バイオインクを押出バイオプリンティング8に使用した。本研究では、アルギン酸ポリマーをペプチドおよびタンパク質で改変した。細胞は、ペプチドおよびタンパク質によって提供される結合部位に起因して、一般的に使用されるアルギン酸塩よりも、この修飾アルギン酸においてより均質な分布を提示した。あるいは、ビオインク中の細胞の沈下を解くために、配合されたバイオインクが利用されている。ポリエチレングリコール(PEG)とゼラチンまたはゼラチンメタクリロイル(GelMA)を含むブレンドバイオインクを、機械的堅牢性の向上を有する別の研究9で使用した。カプセル化された細胞は、主として、配合されたバイオインクの粘度が改善されたため、均質な分布を提示した。一般に、バイオインクの粘度、細胞の重力、細胞の密度、および作業期間の持続性など、バイオインク中のカプセル化された細胞の分散に影響を与えるいくつかの要因がある。これらの要因の中で、細胞の重力は沈積を促進する上で重要な役割を果たす。粘性バイオインクによって提供される浮力と摩擦は、現在までに重力に対する主な力として調査されてきた。
ここで、バイオインク貯留層内の複数の液体インターフェースを操作することにより、バイオインク中のカプセル化された細胞の均質な分散を促進する新しい戦略を開発した。バイオインの多層的な修飾によって作成されたこれらの液体界面は、細胞の沈沈を遅らせる界面保持を提供するだけでなく、バイオインクの適切な生体適合性およびレオロジー挙動を維持することができる。実際には、シルクフィブロイン(SF)を用いた水性GelMA溶液(5%、w/v)を多層的に改変し、4つの界面を縦方向に生成し、ブレンドされたバイオインクに界面緊張を与えました。その結果、人工界面張力によって細胞への重力負荷が相殺され、細胞の隣接する層にわたる沈み込みが少ないため、バイオインク中のカプセル化された細胞のほぼ均質な分散が得られた。液体バイオインク中の界面保持を操作することによってカプセル化された細胞の沈降を遅くする同様のプロトコルは、現在までに報告されていない。ここでは、バイオプリンティングにおける細胞沈積を解決する新しい方法を実証するために、プロトコルを紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マルチレイヤ化システムの安定性は、このプロトコルを正常に実行するための重要なポイントです。我々は、Naumanの研究13に基づいてGelMA溶液中のSF分子の拡散を理論的に計算した。溶液中のタンパク質の拡散は、その分子量に関連していることが分かった。牛血清アルブミン(BSA)の平均分子量(MW)は66.5kDaで、その拡散係数は64-72 μm2/sです。フィブリノーゲンの平均MW?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、中国国立自然科学財団(81771971、81970442、81703470、81570422)、中国国家主要研究開発プログラム(2018YFC1005002)、上海市科学技術委員会(17JC140020)、および主要技術プロジェクト(17JC140020)からの助成金を認めている。 2017SHZDZX01)、上海市教育委員会(イノベーションプログラム2017-01-07-00-07-E00027)。
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
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