Использование многослойного гидрогеля Bioink в трехмерной биопечати для однородного распределения клеток
Summary
Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидковидных биоинков (желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток.
Abstract
Во время экструзио-основанного трехмерного процесса биопечати, жидко-подобные биоинки с низкой вязкостью могут защитить клетки от повреждения мембраны, вызванного стрессом сдвига и улучшить выживание инкапсулированных клеток. Однако быстрое гравитационно-управляемое осадок клеток в резервуаре может привести к неоднородному распределению клеток в биопечатных структурах и, следовательно, затруднить применение жидковидных биоинков. Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидкого биоинка (например, желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток. В многослойной биоинкации манипулировали несколькими жидкими интерфейсами, чтобы обеспечить межфрусное удержание. Следовательно, действие осаждения клеток, идущее через соседние слои в многослойной системе, было отложено в биоинковом резервуаре. Было установлено, что межфрагментальное удержание было гораздо выше, чем осадочный притяжение клеток, демонстрируя важную роль межфрагментационного удержания в предотвращении осаждения клеток и содействии более однородной дисперсации клеток в многослойной биомарке.
Introduction
Трехмерная (3D) биопечать была перспективным методом для производства сложных архитектурных и функциональных копий местных тканей в биофабрике и регенеративной медицине1,2,3. Общие стратегии биопечати, в том числе струйной, экструзии и стереолитографии печати, имеют плюсы и минусы с разных точек зрения4. Среди этих методов, экструзионная процедура наиболее часто используется из-за его рентабельности. Биоинк играет ключевую роль в процессе стабильности экструзионной биопечати. Идеальный клеточный биоинков должен быть не только биосовместимым, но и подходит для механических свойств5. Биоинки с низкой вязкостью обычно представлены как жидкое состояние. Эти биоinks могут быть легко и быстро хранение и избежать повреждения клеточной мембраны, вызванной высоким стрессом сдвига во время экструзии. Однако, в сложных случаях, требующих длительных периодов печати, низкая вязкость часто приводит к неизбежной осадки инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре, который обычно приводит к гравитации и приводит к дисперсии inhomogeneous клеток в биоинке6,7. Следовательно, биоинк с дисперсиями inhomogeneous клетки препятствует биопечати в пробирке функциональной конструкции ткани.
Несколько недавних исследований, посвященных биоинксам, сообщили о продвижении однородной дисперсии инкапсулированных клеток. Модифицированный биоинкт альгината на основе двухсценировки двухсценивания использовался для экструзионной биопечати8. Альгинатный полимер был модифицирован с пептидами и белками в этом исследовании. Клетки представили более однородное распределение в этом модифицированном альгинате, чем в широко используемом альгинате из-за участков вложения, предоставляемых пептидами и белками. Кроме того, смешанные биоинки были использованы для решения осаждения клеток в биоинк. В другом исследовании9был использован смешанный биоинк, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ) и желатин или желатиновый метакрилоил (GelMA) с улучшенной механической прочностью. Инкапсулированные клетки представляли однородное распределение главным образом потому, что вязкость смешанного биоинка была улучшена. В целом, существует несколько факторов, влияющих на дисперсию инкапсулированных клеток в биоинке, такие как вязкость биоинка, гравитация клеток, плотность клеток и продолжительность рабочего периода. Среди этих факторов, гравитация клеток играет важную роль в содействии осаждения. Плавучесть и трение, предоставляемые вязкой биоинка были исследованы в качестве основных сил против тяжести на сегодняшний день10.
При этом мы разработали новую стратегию, направленную на содействие однородной дисперсии инкапсулированных клеток в биоинке путем манипулирования несколькими жидкими интерфейсами в биоинковом резервуаре. Эти жидкие интерфейсы, созданные многослойной модификацией биоинка, могут не только обеспечить межфодное удержание, которое замедляет осадок клеток, но и поддерживать подходящую биосовместимость и реологическое поведение биоинка. На практике мы модифицировали aqueous раствор GelMA (5%, w/v) с шелковым фиброном (SF) многослойным способом, чтобы продольно производить четыре интерфейса, обеспечивая межпараленийные напряжения в смешанном биоинке. В результате гравитационная нагрузка на клетки была компенсирована антропогенным межвидовым напряжением, и почти однородная дисперсия инкапсулированных клеток в биоинке была получена из-за меньшего осаждения через соседние слои клеток. До настоящего времени не было зарегистрировано ни одного подобного протокола, чтобы замедлить осаждение инкапсулированных клеток путем манипулирования межфомационным удержанием жидких бионавов. Мы представляем наш протокол здесь, чтобы продемонстрировать новый способ решения осаждения клеток в биопечати.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стабильность многослойной системы является ключевым моментом для успешного выполнения этого протокола. Теоретически мы рассчитали диффузию молекул SF в решении GelMA на основе исследования Наумана13. Выяснилось, что диффузия белков в растворе связана с их молекулярным весом…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают гранты Национального фонда естественных наук Китая (81771971, 81970442, 81703470 и 81570422), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2018YFC1005002), Комиссия по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (17JC1400200), Шанхайский муниципальный научно-технический крупный проект (Грант No 2017H’S’X01), и Шанхайская комиссия по муниципальному образованию (Инновационная программа 2017-01-07) -00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
